金斯瑞基因合成服務助力！高彩霞團隊開發可編程染色體編輯技術，實現從千鹼基到兆鹼基...

自CRISPR技術問世以來，基於CRISPR與其衍生系統的基因編輯技術層出不窮。人類的基因編輯技術在不到十五年內取得了舉世矚目的成就。CRISPR技術更是在里程碑論文發表九年后斬獲了諾貝爾化學獎。但美中不足的是，目前的絕大部分基因編輯都聚焦於小片段DNA甚至是鹼基編輯，我們的工具庫中缺乏能夠高效編輯幾千鹼基到兆鹼基級別DNA的大尺度基因編輯系統。

圖片來源：Cell

近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所的高彩霞團隊公佈了他們最新研發的大片段DNA編輯工具，該工具能夠在染色體層面實現大尺度的插入、刪除、替換等精細操作，極大地豐富了人類處理大片段DNA的能力。該研究以Iterative recombinase technologies for efficient and precise genome engineering across kilobase to megabase scales為題，於八月發表在生物學頂級期刊Cell上。

提高Cre-Lox系統編輯效率

在本研究之前，科學家已經嘗試將Cre-Lox系統與CRISPR技術結合來實現大段DNA的編輯，但這些技術大多編輯效率低下，編輯尺度也較低。同時，Lox位點的存在會在基因中引入殘留的鹼基，這可能干擾附近基因的表達，這些殘留鹼基也被稱為「疤痕」。

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由於Lox位點主要為互補設計，互補的序列會導致可逆重組的發生。這種可逆性極大的限制了基因編輯的效率與適用範圍。爲了解決這個問題，研究人員建立了分別帶有一個Lox位點的兩個質粒庫，並通過引入隨機突變設計了一個高通量的Lox位點偏好性研究系統。通過這個系統，研究人員發現Lox位點的左臂比右臂更保守，並根據鹼基偏好找到了Lox71和LoxPF兩個位點。

基於這些位點，研究人員設計了4個對稱的Lox位點，並開創性地設計了多個非對稱的Lox位點，然后評估了這些位點的重組頻率與可逆性。不出所料，非對稱的Lox位點設計有效降低了Cre-Lox系統的可行性，幾乎達到了陰性對照水平，而重組效率最高的Acm8和此前報道的位點活性相似。

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在解決了Lox位點的可逆性問題后，研究人員將目光轉向了Cre重組酶，並試圖進一步提高其重組活性。在同期Cell上，高彩霞團隊背靠背發表了一項利用AI技術識別優質突變的研究，但這個名為AiCE的方法並不適用於Cre重組酶這種高度複雜的四聚體系統，更不用説這個四聚體還涉及與DNA的複雜交互。

因此，研究團隊對AiCE進行了改造，將突變優勢與分子相互作用進行了關聯，並得到了重組酶專屬的AiCE_rec。利用AiCE_rec，研究人員設計出了24個Cre的單點變異體，並找到了8個活性顯著提高的單點突變。通過將這些單點突變進行組合，研究人員得到了27個新的突變體，而第24個（cm24）表現出了最高的活性，其活性為野生型的3.5倍。同時，研究人員也探究了cm24所具備的H40E, D141Q, A275P, K276P以及Q281G五個突變提高重組效率的分子生物學依據。

隨后，研究人員將Acm8與cm24進行了組合，同時引入先導編輯系統對特定位點引入Lox位點實現「編程」，並將其命名為「可編程染色體編輯」（PCE）。

高效大尺度DNA編輯

得到PCE后，研究人員首先測試了該系統在水稻中插入18.8kb大片段DNA的效率。結果顯示，比起此前報道的PrimeRoot系統，PCE的插入效率提升了2.3到4.7倍。同樣的插入效率提升在其他植物與不同大小的DNA片段中得到了重現。這證明了PCE在植物中進行大片段DNA插入的優越性。

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除此之外，研究人員還探究了PCE對大片度DNA進行刪除、替換、倒位和易位編輯的效率。較之基於非同源末端連接修復（NHEJ）的倒位編輯系統，PCE的倒位效率提高了17.6倍，在水稻中，優化先導編輯后的PCE能夠對315kb的大片段DNA進行精準倒位，倒位率高達20.1%；而PrimeRoot的倒位率僅有2.8%。同時，PCE可以輕易替換5kb的DNA片段以及高達4Mb的基因刪除，同時擁有約1%的染色體易位編輯效率。這些數據都證明PCE具有強大的大尺度基因編輯能力。

無痕編輯

當前PCE需要通過先導編輯引入Lox位點，但基於Cas9的先導編輯依賴前間隔相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）發生作用。對PAM的剛需極大限制了Lox位點的選擇，而此前報道的SpRY, BCA與FCA變體能夠實現不依賴特定PAM的基因編輯。基於這些先例，研究人員利用此前報道的ePPEplus系統進行了快速進化，並得到了SpRY-ePPEplus。SpRY-ePPEplus能夠對所有研究的PAM序列進行高效插入，這極大了擴寬了PCE的應用範圍。

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在對Lox位點、Cre 重組酶以及先導編輯三個組件進行優化后，研究人員將目光轉向了Cre-Lox系統留下的「疤痕」，這些疤痕的存在可能影響附近基因的表達。但研究團隊已經獲得了不依賴PAM的SpRY-ePPEplus，這意味着只要他們在PCE后再次進行先導編輯，就可以輕易把Lox位點留下的疤痕除掉。

通過二次先導編輯，研究人員最終獲得了能夠實現「無痕」編輯大片段DNA的RePCE系統，並在水稻中通過將GFP分三段引入后去除疤痕證明了其有效性。隨后，研究人員對兩次先導編輯的序列進行了進一步優化，解決了LoxP疤痕去除效果不佳的問題，同時進一步提高了無痕編輯的效率。

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最后，研究人員進一步探究了RePCE在人類疾病中的應用可能性，並對尤文肉瘤與非小細胞肺癌的致病基因進行了無痕編輯。儘管編輯效率不到2%，且存在一定程度的脱靶現象，但研究結果還是初步驗證了RePCE在臨牀中應用的潛力，也為RePCE的進一步改進指明瞭方向。

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本研究通過一系列的巧思，解決了困擾基因編輯領域的數個難題，並搭建出來一個能夠實現大片段DNA精準無痕編輯的系統，讓人類獲得了在染色體層面修改遺傳信息的能力。

本研究中所用的Cas9變體（BCA和FCA）基因序列經密碼子優化后由金斯瑞完成合成。

金斯瑞作為先進的基因合成公司之一，基因合成通量可達3萬條/月，合成基因可長達200kb。金斯瑞還可以為客户提供高質量的質粒構建、基因突變、質粒DNA製備、ORF克隆服務、GenBrick長片段基因合成和基因突變文庫構建等下游服務，全面涵蓋您的分子生物學實驗需求。

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參考資料：

1. Iterative recombinase technologies for efficient and precise genome engineering across kilobase to megabase scales: Cell

(金斯瑞生物科技)