默新探——探索Sf-RVN昆蟲細胞表達系統的潛力與應用：推動疫苗與基因治療的革命

近日，首個基於Sf-RVN®細胞表達的VLP疫苗獲得藥物臨牀試驗批准，吸引了生物製藥行業的廣泛關注。在病毒樣顆粒（VLP）的生產技術方面，昆蟲細胞表達系統展現出革命性的潛力，成為疫苗研發的前沿方向。此外，在重組腺相關病毒（AAV）的生產中，昆蟲細胞表達平臺也展現出獨特優勢，包括更高的安全性、良好的可放大性、簡化的工藝流程以及更低的生產成本。本文將深入探討昆蟲細胞表達系統的發展歷程，揭示這一強大真核生物表達體系的實力。

昆蟲細胞的歷史與發展

自20世紀80年代開發昆蟲細胞表達系統以來，它已成為重組蛋白、疫苗和病毒載體生產的重要平臺。最早的應用可追溯到1983年，科學家首次利用桿狀病毒（Baculovirus）感染昆蟲細胞（Sf），成功表達外源蛋白。自1990年代起，該昆蟲細胞桿狀病毒表達系統（BEVS）因其高表達量、翻譯后修飾能力及對大分子蛋白的良好摺疊，廣泛應用於科研和生物製藥領域。

昆蟲細胞的優勢

與傳統哺乳動物細胞相比，昆蟲細胞具有更高的安全性，培養條件簡單，易於大規模放大，且生產成本較低等特點。這些優勢也使其成為重組蛋白、疫苗、新型基因治療載體（如AAV，Glybera®）生產的理想選擇。

類哺乳動物翻譯后修飾能力

昆蟲細胞（如Sf9/Sf21）可執行復雜的糖基化修飾，其N-糖基化模式比酵母/細菌更接近哺乳動物系統，特別適合生產需要正確摺疊和功能修飾的治療性蛋白。

桿狀病毒表達系統的高效性

昆蟲細胞在使用桿狀病毒表達系統（BEVS）時，能夠實現高效的重組蛋白生產。通過基因工程改造，昆蟲細胞的存活率和產量得以提高。例如，研究表明，通過延長細胞的存活時間和優化培養條件，可以顯著提升重組蛋白的產量。

生物安全性優勢

由於昆蟲細胞和桿狀病毒對人類是非感染性的，這使得它們在生產治療性蛋白時具有較高的安全性。這一點在疫苗生產中尤為重要，因為它們不會引起人類的免疫反應或感染風險。

工藝開發靈活性

昆蟲細胞平臺允許使用多種表達系統，包括傳統的桿狀病毒感染和直接的質粒轉染。這種靈活性使得生產過程可以根據具體需求進行調整，適應不同類型的重組蛋白或病毒樣顆粒（VLPs）的生產。

快速響應能力

昆蟲細胞系統的適應性和快速生長特性，使得它們能夠在短時間內進行實驗和優化。這對於快速響應疫苗需求或新葯開發至關重要，特別是在應對快速變異的病毒（如流感或SARS-CoV-2）時

昆蟲細胞在疫苗開發中的應用

昆蟲細胞表達系統在複雜蛋白結構的製備領域展現出革命性的潛力，尤其是在病毒樣顆粒（VLP）的生產技術方面，已成為疫苗研發的前沿方向。VLP是由病毒蛋白自組裝而成的納米級結構，其大小和形態特徵與天然病毒高度相似，但不含病毒複製基因組，從根本上消除了感染風險。由於保留了病毒來源的結構，VLP能夠被宿主的免疫系統有效識別，從而誘導細胞和體液免疫反應。這些特性使得VLP在疫苗開發中尤為引人注目，因為它們不僅能有效激發免疫反應，還不會增加宿主細胞中病毒複製的風險，為新型疫苗的開發提供了安全性與高效性的創新路徑。

基於昆蟲細胞系的獨特優勢，桿狀病毒表達載體系統（BEVS）已成為VLP生產的核心平臺。該系統不僅能夠實現複雜多聚體蛋白的精準組裝（如流感病毒血凝素三聚體），還可快速完成從基因克隆到VLP純化的全流程，顯著優於哺乳動物細胞系統的生產周期。這種快速響應能力在應對流感、SARS-CoV-2等快速變異病毒時展現出獨特的戰略價值。

當前主流的VLP製備技術包括：

1. 經典的Bac-to-Bac系統

2. 基於MultiBac技術的多基因表達系統，或與多個桿狀病毒載體共同感染昆蟲細胞

3. 穩定重組昆蟲細胞系的應用

4. 基於質粒的生產技術（Lampinen等成功製備諾如病毒、輪狀病毒和腸病毒-LP，簡化下游桿狀病毒去除步驟）

昆蟲細胞在基因療法中的應用

基因療法的復興為無法治癒的疾病患者提供了救命選擇，導致對大量高質量病毒載體的需求激增。無輔助的腺相關病毒（AAV）載體通常通過瞬時轉染人胚腎（HEK）293細胞製備，使用三種質粒，分別攜帶：(1) AAV基因組轉移載體，(2) 編碼衣殼和複製蛋白的AAV Cap和Rep基因，以及(3) 腺病毒輔助功能。儘管這一系統在實驗室規模上優化AAV載體非常方便，但由於轉染過程的複雜性，它在大規模生產中面臨重大挑戰。

相比於穩定的染色體整合或瞬時轉染，BEVS生產依賴病毒載體傳遞外源遺傳信息，具有更易於放大、更高的靈活性、更快的製造速度、更低的成本和更具競爭力的滴度。生物製藥公司正在利用昆蟲細胞表達系統生產重組AAV（rAAV）以治療遺傳疾病。實際上，這種基於昆蟲細胞的表達系統曾用於AAV基因治療藥物Glybera，該藥物於2012年獲得歐洲藥品管理局（EMA）的批准。

表1. 基於BEVS的人類和動物商業化疫苗及治療藥物

安全性與監管挑戰

對於生物製藥行業而言，確保產品的安全性至關重要。監管機構要求在生物製藥生產過程中進行廣泛的病毒檢測和清除程序。隨着昆蟲細胞在生物製藥領域的應用越來越廣泛，FDA、中國藥典等對昆蟲細胞的鑑定也提出了更具體的監管要求。

2025版藥典《生物製品生產用動物細胞基質製備及質量控制》新增昆蟲細胞鑑定的特殊要求：

「支原體/螺原體：

昆蟲細胞，或細胞培養過程中使用了植物源性材料，應進行螺原體檢查，所用方 法如培養法或核酸法應能檢測中間原體屬和蟲原體屬」

「種屬性特異性外源病毒因子的檢測：

昆蟲細胞系，應考慮檢測已報告污染的特定病毒(如諾達病毒)，或可能持續存在於昆蟲細胞系中並已知對人類具有傳染性的病毒。」

FDA行業指南：用於人類基因治療研究性新葯申請 (IND) 的化學、製造和控制 (CMC) 信息中對昆蟲細胞庫鑑定要求如下：

- For other animal or insect cells, we recommend tests for species-specific viruses, as appropriate. For instance, for Vero cells, we recommend testing for simian polyomavirus SV40 and simian retrovirus.

- For insect cells, you should evaluate the presence of arboviruses in a susceptible cell line, such as baby hamster kidney (BHK21) cells. Insect cell lines with known viral contamination should be avoided.

2014年，FDA逆轉錄病毒實驗室結合傳統方法（如RT-PCR和電子顯微鏡觀察）與現代高通量測序（MPS）和深入的生物信息學分析，發現大多數Sf細胞（如Sf9）中都含有一種未知的Sf-rhabdovirus (Sf-彈狀病毒)。通過對Sf9細胞過濾上清樣本進行透射電子顯微鏡觀察，確認了彈狀病毒的形態。感染性研究表明，Sf-rhabdovirus可能在其他昆蟲細胞系中引起短暫感染，但在人類細胞系中沒有發現病毒進入或複製的證據。Sf-rhabdovirus序列也在Sf9細胞的母系Sf21細胞系中發現，但在其他昆蟲細胞系中未發現，表明存在物種特異性感染。

Sf-rhabdovirus作為一種種屬性特異性外源病毒因子，在使用昆蟲細胞進行生產時需要通過多重策略進行嚴格控制，包括選擇和測試細胞系、評估生產過程的病毒清除能力以及在生產的適當步驟中進行病毒檢測，以確保產品的安全性和有效性。

Sf-RVN®細胞系—從源頭提升安全性

Dr. Jarvis和GlycoBac實驗室於2016年找到彈狀病毒陰性的sf9細胞，並通過TBLASTN程序對大規模平行測序組裝進行搜索，確認Sf-RVN®昆蟲細胞系中不存在任何病毒序列。在對彈狀病毒呈陰性的同時，該Sf-RVN®昆蟲細胞系在密度、大小、倍增時間和形態上與感染彈狀病毒的Sf9細胞系相似，證明其同時保持了標準Sf9細胞系的其他特徵。默克為Sf-RVN®昆蟲細胞專門發開的EX-CELL®化學限定昆蟲細胞培養基，可實現該細胞系的優良生長和生產力。

圖4. Sf-RVN®昆蟲細胞與感染彈狀病毒的Sf9細胞在密度（A）、直徑（B）、倍增時間（C）和形態（D）方面的比較顯示出相似性

Sf-RVN®昆蟲細胞COA中螺原體和彈狀病毒檢測：

未來展望

在未來的研究中，科學家們可能會探索更多的昆蟲細胞系的表達體系，以提高生產效率和產品質量。此外，結合人工智能和機器學習等新興技術，優化昆蟲細胞的培養和生產過程，將是一個重要的研究方向。總之，昆蟲細胞平臺以其獨特的優勢和廣泛的應用前景，正在推動生物製藥和疫苗開發的變革。通過合作與創新，昆蟲細胞平臺必將在未來的生物製藥領域中發揮越來越重要的作用。

參考文獻

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6. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs). Guidance for Industry

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