海大突破性發現，國際上首次！揭開無脊椎動物的「生命密碼」

中國海洋大學在動物骨骼造血研究領域取得突破性發現，在國際上首次證實無脊椎動物骨骼中普遍存在造血干細胞巢——

一次「失誤」揭開無脊椎動物的「生命密碼」

在大眾的固有認知中，貝殼不過是貝類用來保護自身的「石頭外殼」，是毫無生命的碳酸鈣礦物質，事實果真如此嗎？

王師正在藉助電腦觀察實驗中貝殼的殼內細胞分佈情況。 楊琪琪

近日，中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室、方宗熙海洋生物進化與發育研究中心包振民院士和王師教授團隊在國際權威學術期刊《科學進展》發表的最新研究成果，在國際上首次揭示了無脊椎動物骨骼中普遍存在造血干細胞巢，顛覆了骨骼造血為脊椎動物特有的傳統觀念，為理解動物骨骼造血系統的起源和演化提供了全新視角。

貝殼里可能存在活細胞

該項研究成果題為「無脊椎動物骨骼中普遍存在‘類骨髓’造血干細胞巢」。「這個發現源於一次實驗中的‘意外發現’。」海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室、方宗熙海洋生物進化與發育研究中心王師教授回憶道。傳統觀念認為，貝殼是由外套膜，即貝類邊緣的特殊組織分泌形成的。儘管很早學術界就已發現貝殼里能夠檢測到DNA核酸分子，但通常認為這是源自外套膜細胞在分泌礦化物質時，死掉的細胞被包裹進貝殼里而形成的殘留「遺蹟」。2017年，團隊在用常規軟體組織核酸提取方法處理新鮮貝殼的過程中，遇到了反常的問題：樣本不僅能夠檢測到DNA，還意外發現活細胞的指示物―RNA的存在。

「按照生物學常識，RNA極不穩定，在活細胞外會快速降解，而貝殼一貫被認為是‘無生命’的礦化物，本不該有RNA殘留。」王師説，團隊最初懷疑是貝殼內表面的軟體組織未清理乾淨導致樣本污染，但在徹底清理后，仍能檢測到RNA的存在。這一發現讓團隊意識到，貝殼里可能存在活細胞。「這意味着我們過去認為的‘無生命的石頭’―貝殼，其實是一個活的器官，這是最根本的觀念顛覆。」

這個「意外」，成為突破傳統認知的第一道裂縫。然而，要證明貝殼里有活細胞，首先需要「眼見為實」。為此，團隊花了近半年時間，嘗試去除貝殼表面堅硬的碳酸鈣層，暴露內部的有機質層，「可以把貝殼想象成牙齒，我們要做的就是把外面堅硬的牙釉質去除，看到里面的牙髓。」該研究主要完成人連姍姍副教授介紹，這項工作成功后，團隊又開始反覆優化染色和固定方法，便於在顯微鏡下觀察細胞的分佈。「一開始染色效果非常不理想，因此我們做了很多嘗試，最終選擇了‘邊脱鈣邊固定’的方式，儘可能保持細胞的完整形態。」最終，該團隊成功脱除了貝殼的部分鈣質層，並通過染色清晰地觀察到了細胞的存在和分佈，證實了貝殼里確實存在具有活性的細胞。

王師（右一）為團隊成員講解貝殼的生長特性。 楊琪琪 攝

貝殼內的造血干細胞比例高達40%-60%

這些存活於貝殼中的細胞屬於何種類型、有着什麼樣功能？如何揭開這層謎團，成為團隊后續研究中亟待攻克的又一關鍵難題。

「前期我們檢測到的貝殼RNA，通過比較轉錄組分析提示其具有類似干細胞特徵，但我們不確定具體有多少干細胞、是否存在其他細胞。單細胞測序技術的發展給了我們很大幫助，也提出了更大的挑戰。」連姍姍告訴記者，該實驗的核心難點在於，之前觀察細胞形態，只需要保持細胞結構完整，但單細胞測序技術通常要求對活細胞進行分析。僅解決這一問題就耗費了團隊近一年時間。「后來我們摸索出了相對直接的方法：一是分析貝殼內偏好表達的膠原類型；二是短時間內將貝殼物理破碎成小塊，這樣能顯著加快脱鈣速度。但破碎后，脱鈣產生的有機膜片非常細小，需要大量人力一片片地手工挑取出來。挑出來后，再通過物理方法，如研磨、酶解等，將細胞從膜片中釋放出來，最后才能進行單細胞測序上機分析。」連姍姍一邊説，一邊指了指實驗臺上大量坑窪的小洞，「這都是我們前期實驗留下的痕跡。這一過程聽起來不算複雜，實則非常考驗實驗者的實驗流暢度，必須在最短時間內完成上述操作，以確保細胞的活性。其中任何一步出現問題，都要從頭再來。」

功夫不負有心人。藉助單細胞測序技術，團隊發現，與高等脊椎動物骨髓中造血干細胞或前體細胞極低比例（通常<10%）相比，貝殼內的造血干細胞比例高達40%-60%。同時，貝殼內的細胞羣體構成了一個造血干細胞巢，其組學特徵、遺傳調控機制、干細胞微環境、發育起源和分化、生物學功能等多個維度均支持與高等脊椎動物造血譜系具有同源性，打破了脊椎動物骨骼造血系統為「高等演化」的傳統認知。

隨后，團隊又藉助侏儒蛤這一殼薄、生長速度極快的小型貝類對貝殼干細胞的功能進行了驗證。研究人員在其貝殼中央，遠離外套膜的區域進行人為鑽孔，「按照傳統理論，這個位置的外套膜鞭長莫及，修復應該很慢甚至無法完成。

結果令人驚訝：9天后有機質層開始癒合，2至3周后出現礦化沉積——這直接證明了殼內細胞能驅動貝殼修復。」連姍姍介紹，隨后，團隊又通過反覆抽血實驗和原位雜交手段觀察得出，干細胞標誌物的表達呈現梯度分佈——離殼近的地方多，離殼遠的地方少。「發現貝類造血干細胞同時具有生物礦化功能，不僅挑戰了外套膜作為唯一貝殼礦化組織的傳統認知，同時也揭示了造血與礦化在動物祖先的深層次演化聯繫。」

「爲了能夠更充分地證明我們的研究成果，在原有實驗基礎上，我們還做了許多努力。在前期原位雜交標記遷移基礎上，我們藉助熒光染料對染色細胞進行了分選，發現這些分選出來的細胞在體外能夠增殖。我們還加入了一些誘導分化的因子，觀察到它們有向血細胞分化的趨勢。這均證明我們分選到的細胞具有高等哺乳動物造血干細胞的兩大核心特徵：自我更新和分化潛能。」連姍姍介紹。此外，研究團隊還發現，甲殼動物、棘皮動物和硬骨魚等其他動物類羣的礦化骨骼中也存在類似造血干細胞巢，並揭示出動物祖先造血干細胞核心調控基因集，提出「骨骼干細胞巢的重大演化創新為寒武紀動物大爆發的重要驅動力」的新理論學説。經過8年多的不斷補充和完善，該團隊的研究成果才得以正式刊出。

據悉，「無脊椎動物骨骼內普遍存在造血干細胞巢」的原創性發現，為迄今國際上首次發現存在跨動物界保守的普適性干細胞巢，是生命科學領域的重要進展，顛覆了骨骼造血為脊椎動物特有演化創新的傳統觀念，解答了長期困擾學術界的無脊椎動物造血干細胞來源之謎。該項原創發現不僅為理解動物造血系統起源演化提供了全新視角，也為海洋生物干細胞研究開闢了新領域和新方向。

目前，該團隊已啟動「DeepShell」項目，該項目將研究目標從最初9個物種擴展到近50個，涵蓋整個動物界的主要動物骨骼類羣和完整進化鏈條。「我們想以更為宏觀的研究視角確認這一發現的普遍性，更想探索無脊椎動物類羣骨骼干細胞高丰度的維持機制。」王師表示，這些機制可為人類再生醫學領域干細胞研究或治療策略研發提供重要啟示。（青島日報/觀海新聞記者 楊琪琪 實習生 萬劉鑫）

責任編輯：王臻

（作者：楊琪琪)