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博格隆純化解析丨指南一鍵解鎖，輕松選對His標籤蛋白純化層析介質
2025-04-28 10:44
蛋白純化是重組蛋白生產流程中關鍵的下游步驟（Fig.1）。由於重組蛋白自身在化學與結構上的多樣性，親和標籤已成為實現高通量蛋白純化的有效手段，可在複雜背景下特異性富集低丰度蛋白，不僅可以提高目標蛋白質的產量還可賦予目標蛋白質新的特性[1]。
His-Tag（通常為6個組氨酸）作為目前最常用的蛋白質純化親和標籤[2]，具有以下特點：
• 分子量小，易表達，免疫原性低
• 可與其他標籤構建組合標籤
• 洗脱條件温和，易於再生
• 成本低
Fig. 1 A. 通過與目標蛋白基因融合的 His 標籤獲得純重組多肽流程示意圖。B. Ni-NTA 和組氨酸咪唑環之間配位鍵的放大顯示[3]。
注：活動順序涉及基因設計、克隆、細胞轉化、生產、基於 His 標籤在鎳柱 (I) 中結合，隨后使用咪唑 (II) 進行洗脱。
His標籤蛋白分離純化原理
組氨酸殘基中咪唑環的給電子體基團可與金屬形成配位鍵[4]，因此，在純化過程中，改變標籤蛋白與金屬離子之間作用力的強弱即可純化目標蛋白。純化時，通常選擇在緩衝液中加入高濃度的咪唑，咪唑與組氨酸標籤蛋白競爭性結合金屬離子，將目標蛋白洗脱下來。此外，也可適當降低緩衝液pH，以此減弱標籤蛋白與金屬離子結合能力，達到蛋白分離純化的目的。
Fig. 2 組氨酸與咪唑結構式
博格隆His標籤蛋白純化解決方案
針對His標籤蛋白的純化，博格隆提供了三類His標籤純化產品（Fig.3），包括已鰲合Ni2+的Ni Bestarose FF/HP親和層析介質以及未預先鰲合金屬離子的IMAC Bestarose FF/HP親和層析介質與Chelating Bestarose FF親和層析介質。
Ni Bestarose FF/HP是將金屬離子Ni2+鰲合在以氨三乙酸（NTA）為配基的6%高度交聯的瓊脂糖凝膠上的親和層析介質。其中，Ni Bestarose FF親和層析介質平均粒徑為90 μm，具有載量高、流速快、易再生等優點；Ni Bestarose HP親和層析介質平均粒徑為34 μm，相較於Ni Bestarose FF親和層析介質，具有更高的分辨率。
IMAC Bestarose HP/FF與Chelating Bestarose FF均是未預先鰲合金屬離子的親和層析介質，可供客户自行選擇金屬離子（Co2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+等）進行偶聯。IMAC 與Chelating在配位方式上有所不同，Chelating Bestarose FF親和層析介質的配基可提供3個配位位點同金屬離子螯合，同時提供3個離子鍵結合部位高親和地純化目的蛋白；IMAC Bestarose FF親和層析介質提供4個配位位點同金屬離子螯合，2個離子鍵結合部位純化目的蛋白（Fig. 4）。
在相同的配基密度、相同金屬離子條件下，Chelating Bestarose FF親和層析介質較IMAC Bestarose FF親和層析介質的親和力更強，但同時IMAC Bestarose FF親和層析介質因為多一個金屬離子螯合位點，結合金屬離子的能力更強，還可以同還原劑DTT及β-巰基乙醇兼容。因此，在純化重組組氨酸標籤蛋白時應根據蛋白特點選擇介質。
Fig.5 His標籤蛋白純化親和填料選擇指南
應用案例：使用Ni Bestarose FF純化帶有His標籤的熒光蛋白
• 填料：Ni Bestarose FF （1 mL EzFast）；
• 樣品：大腸桿菌裂解液；
• Buffer A：25mM咪唑 pH 7.0；
• Buffer B：500mM咪唑 pH 7.0；
• 流速： 1 mL/min。
如Fig.6所示，Ni Bestarose FF親和層析介質具有良好的純化效果。
Tips:
由於Ni 柱不可耐受DTT、EDTA等強還原劑與強螯合劑，一般在進行蛋白純化之前建議通過透析或脱鹽的方式進行置換緩衝液。在產品選擇方面，推薦使用Bestdex G-25 M凝膠過濾填料或預裝柱進行脱鹽或緩衝液置換。Bestdex G-25 M具有親水多孔的特點，利用分子篩原理可快速便捷地處理高達脱鹽柱總體積30％的樣品，有效提高His標籤蛋白與Ni柱結合能力，同樣經Ni柱純化后的洗脱樣品也可使用Bestdex G-25 M去除高濃度咪唑。
相關產品參數信息
Fig.7 His 標籤蛋白純化產品
Table 1．Ni填料技術參數
Table 2．金屬鰲合親和層析介質技術參數
Table 3．Bestdex G-25 M凝膠過濾層析介質技術參數
相關產品信息
• Ni 系列金屬螯合親和層析介質
• Ni 系列金屬螯合親和預裝柱
• IMAC/Chelating金屬螯合親和層析介質
• IMAC/Chelating金屬螯合親和預裝柱
• Bestdex G-25 M凝膠過濾層析介質
更多規格產品請登陸博格隆官方網站查詢。
參考文獻：
[1] Loughran ST, Bree RT, Walls D. Purification of Polyhistidine-Tagged Proteins. Methods Mol Biol. 2017; 1485:275-303.
[2] Waugh DS. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 2005 Jun;23(6):316-20.
[3] López-Laguna H, Voltà-Durán E, Parladé E, Villaverde A, Vázquez E, Unzueta U. Insights on the emerging biotechnology of histidine-rich peptides. Biotechnol Adv. 2022 Jan-Feb; 54:107817.
[4] Watly J, Simonovsky E, Wieczorek R, Barbosa N, Miller Y, Kozlowski H. Insight into the coordination and the binding sites of Cu (2+) by the histidyl-6-tag using experimental and computational tools. Inorg Chem. 2014 Jul 7;53(13):6675-83.
關於博格隆
博格隆成立於2008年，是一家專注於為分離純化提供高質量層析介質的高新技術企業，是中國較早具備大規模生產分離純化介質能力的企業之一。博格隆所提供的產品涵蓋各類分離純化介質、預裝柱、實驗室及工業生產級空柱、微載體，同時提供分離純化工藝開發服務及填料定製。
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