NK細胞培養攻略

轉自：優寧維抗體專家

自然殺傷細胞（nature killer，NK）是除T細胞、B細胞之外的第三大類淋巴細胞，可自發識別體內異常細胞，並通過細胞毒性作用將其迅速清除，同時產生各類促炎因子和趨化因子，招募和激活其他免疫細胞以啟動適應性免疫反應。

接下來小優會從NK細胞來源-體外擴增培養-鑑定-熱門研究四個方面帶大家通關不同來源的NK細胞培養！之前小優也給大家介紹了《免疫衞士-T細胞培養攻略》，《DC細胞培養攻略》，《B細胞培養攻略》，小夥伴們按需查看呦~

NK細胞來源

NK細胞來源於骨髓淋巴樣干細胞，其分化、發育依賴於骨髓微環境，主要分佈於骨髓、外周血、肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結，約佔外周淋巴細胞的5-20%。在血液、骨髓、脾臟和肺部，NK細胞主要是成熟（CD56dimCD16+）和終末分化（CD56dimCD16+CD57+）的亞羣，具有較高的效應功能。在淋巴結、扁桃體和腸道中，NK細胞的頻率較低，主要由不成熟（CD56brightCD16−）亞羣組成，這些亞羣的效應能力較低[1]。

所以體外培養的NK細胞來源可以是實體組織（骨髓、脾臟、肝臟、淋巴結等）、血液、直接購買商品化的原代NK細胞或NK細胞系（NK-92等）。具體樣本製備和細胞分選的內容，小夥伴們可以參考之前的文章：《免疫細胞培養通關技巧之樣本製備》和《免疫細胞培養通關技巧之細胞分選》。

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小鼠脾臟組織解離試劑盒，高效製備單細胞懸液

用作心臟、骨、肝、甲狀腺、唾液腺和軟骨等組織的原代細胞製備

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用於消化胰島細胞以及對細胞表面受體完整性有較高要求的實驗樣本

NK Cell Isolation Kit, human 130-092-657

快速温和地從人PBMC中陰性分選NK細胞

NK細胞體外擴增培養

NK細胞體外也面臨着很多挑戰：NK細胞在外周血中佔比很低，PBMC起始擴增NK比例低；NK細胞不易擴增且容易耗竭，培養需要加入血清或飼養層細胞；NK細胞擴增之后很難維持其細胞毒性作用，因此我們可以使用不同的NK細胞培養因子組合方案以應對上述挑戰：IL-2&IL-12&IL-15可促進NK細胞分化擴增；IL-12&IL-18可增強NK細胞抗原敏感性；IL-21可增強NK細胞的細胞毒性作用。 

接下來，小優用四個案例給大家詳細介紹：

01

外周血來源的NK細胞（PB-Derived NK Cells）

① 調整人全血中分選的NK細胞密度為1*106 cells/mL，重懸至含有5%血清的X-VIVO 15培養基中；

② 加入200 U/mL IL-2，10 ng/mL IL-15和1*106 cells/mL的K562細胞（絲裂黴素處理滅活）。在15天的擴增過程中，每隔2-3天對NK細胞進行一次傳代，補充細胞因子和新鮮製備的K562細胞[3]。

02

臍帶血來源的NK細胞（UCB-Derived NK Cells）

①分選CD34+細胞：從臍帶血中使用CD34陽性選擇磁珠分離表達CD34的造血干細胞/祖細胞；

②將分選出的CD34+細胞以造血干細胞分化培養基（DMEM/F12+ 20%熱滅活人AB型血清+ 5 ng/mL亞硒酸鈉、50 µM乙醇胺、20 mg/mL抗壞血酸+ 2 mM L-谷氨醯胺、1%雙抗、25 µM β-巰基乙醇）重懸，接種在經過照射處理的OP9-DLL4細胞上，並保持添加下列細胞因子，5 ng/mL IL-3（僅第一周添加），20 ng/mL SCF，10 ng/mL IL-15，10 ng/mL FLT3L，20 ng/mL IL-7；

③每周更換一次培養基以提供持續的營養和生長因子支持，28至35天左右可通過流式細胞術檢測細胞表面標誌物的變化，當細胞發展成為CD45+CD56+CD33−CD3−表型時，説明已經發育成為NK細胞[4]。

03

hPSC來源的NK細胞[5]

1）造血祖細胞分化

①使用OP9骨髓基質細胞作為支持細胞，與H1細胞（α-MEM+20%FBS）共同培養來誘導造血祖細胞分化；

②共同培養大約12天后，在培養物中可以觀察到許多分化的菌落，並且能夠檢測到小部分CD34+細胞的存在。

2）誘導NK細胞分化

①收穫經過「造血祖細胞分化」階段后獲得的細胞，並將其與表達Notch配體Delta-like-1（DLL1）的OP9細胞變體（OP9-DLL1細胞）共培養；

②在含有20% FBS、10 ng/mL SCF、5 ng/mL FLT3L、5 ng/mL IL-7、10 ng/mL IL-15的α-MEM培養基中，每周進行一次這樣的共培養。

③第一周期共培養結束后（第19天），大部分細胞仍然保持貼壁生長狀態。

④第二周期（第26天），開始出現一些明亮、圓形、半懸浮的細胞。

⑤第三周期（第33天），這些細胞逐漸脱離並聚集在培養孔中心。

⑥第四周期（第40天），更多的懸浮細胞顯現出來，形態上表現為小型、圓形、明亮的淋巴細胞；可通過流式細胞術鑑定，細胞表型為CD45+CD56+CD3−TCRαβ−CD4−CD8−，即NK細胞。

hPSC誘導NK細胞過程中形態監測[5]

04

NK細胞系：NK-92

NK-92細胞系的培養相較於原代NK細胞來説要簡單很多，調整NK細胞密度為2.5×105/mL，重懸至完全培養基（RPMI 1640+5%FBS+2 mM L-glutamine+10 U/mL雙抗+20 U/ml IL-2）[6]，每2-3天更換新鮮的完全培養基。

小優也匯總了上述各種來源的NK細胞體外擴增培養方案，可供參考~

NK細胞鑑定

NK細胞亞型鑑定最常用的方法是流式，關於流式鑑定的基本內容大家可以參考《免疫細胞培養通關技巧之分型鑑定》。Human常用NK鑑定指標為：CD3-CD56+CD16+/-。人NK細胞常分為CD56++CD16+/-和CD56dimCD16++兩個亞羣，外周血或其他非純化NK細胞的樣本，檢測時還要加上CD3同時檢測，以排除一類特殊T細胞—NKT（CD3+CD56+）。Mouse常用NK鑑定指標為CD3e-CD49b+NK1.1+NKP46+，但NK1.1和CD49b選擇要根據小鼠的品系：NK1.1：表達在C57BL，FVB/N, NZB，但在AKR，BALB/c，CBA/J，C3H，C57BR，C58，DBA/1，DBA/2，NOD，SJL，129中不表達。CD49b：由於還會表達在胸腺上皮細胞、B細胞、單核細胞等中，在用於NK鑑定時，更推薦抗原克隆位點為DX5的抗體，特異性會更強，基本所有小鼠品系都表達，但在NOD中不表達。更多詳細內容可以查看《人和小鼠的NK細胞研究指標怎麼選？》。

人NK細胞分型、比例、標記物、分佈及功能（源自美天旎）

小鼠NK細胞分型、比例、標記物、分佈及功能（源自美天旎）

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NK細胞熱門研究

NK細胞的熱門研究也非常多，比如腫瘤微環境中NK細胞亞型和功能、NK細胞耗竭、腫瘤免疫逃逸、NK細胞與其他細胞之間的相互作用、CAR-NK、NK細胞功能研究等等。例如24年的一篇文章將NK細胞、T細胞、腫瘤細胞一起共培養，加入三聯抗體后，通過共聚焦顯微鏡成像和ELISA檢測共培養上清中細胞因子的含量，以觀察三聯抗體是否可以增強NK細胞和T細胞與腫瘤細胞的相互作用，並且刺激兩者細胞毒性顆粒的釋放（圖1）[7]。

NK細胞、T細胞、腫瘤細胞共培養[7]

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關於NK細胞的培養就到這里啦，更多細胞培養攻略敬請期待~

參考文獻：

1. Dogra, P., et al., Tissue Determinants of Human NK Cell Development, Function, and Residence. Cell, 2020. 180(4): p. 749-763.e13.

2. Crinier, A., et al., SnapShot: Natural Killer Cells. Cell, 2020. 180(6): p. 1280-1280.e1.

3. Li, F., et al., CCL5-armed oncolytic virus augments CCR5-engineered NK cell infiltration and antitumor efficiency. Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 2020. 8(1).

4. Goldenson, B.H., et al., Umbilical Cord Blood and iPSC-Derived Natural Killer Cells Demonstrate Key Differences in Cytotoxic Activity and KIR Profiles. Frontiers in Immunology, 2020. 11.

5. Zeng, J., et al., Generation of 「Off-the-Shelf」 Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports, 2017. 9(6): p. 1796-1812.

6. TÖRnroos, H., H. HÄGerstrand, and C. Lindqvist, Culturing the Human Natural Killer Cell Line NK-92 in Interleukin-2 and Interleukin-15 – Implications for Clinical Trials. Anticancer Research, 2018. 39(1): p. 107-112.

7. Ye, Q.N., et al., Orchestrating NK and T cells via tri-specific nano-antibodies for synergistic antitumor immunity. Nat Commun, 2024. 15(1): p. 6211.

（轉自：優寧維抗體專家）