CRISPR干預的CHO細胞系開發方法

摘要：對於工業生產重組蛋白生物製藥，中國倉鼠卵巢（CHO）細胞因其能夠生產具有人類樣翻譯后修飾的高質量生物製劑而成為最廣泛採用的宿主細胞系統。與隨機整合不同，基因組安全港位點的靶向基因組編輯為CHO細胞系工程提供了新的視角，確保了長期培養中的生產一致性和高生物治療表達水平。隨着CRISPR-Cas系統知識的巨大進步，CRISPR-Cas技術的使用以及供體設計策略已被推向細胞系工程中的越來越多的新場景，允許科學家快速、方便、高效地修改哺乳動物基因組，例如CHO細胞系。根據策略和生產需求，感興趣的基因也可以在單個或多個位點整合。本綜述將概述CHO細胞系開發中最基本和最新的進展，例如不同的細胞系工程方法以及供體設計策略，用於將所需的構建體有針對性地整合到基因組熱點中，這最終可能導致快速產品開發過程，具有一致的、提高的產品產量和質量。

1.引言

在工業生產重組治療蛋白方面，哺乳動物細胞，特別是基於中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的系統，發揮着最關鍵的作用。這種優勢與其他表達系統如細菌、昆蟲、轉基因動物和植物相比，由於它們強大的蛋白質組裝、摺疊和適當的翻譯后修飾（PTM）能力。CHO框架包括可以在懸浮中生長的特性，這些特性可以在滿足工業需求的規模上發展；例如，細胞可以在無血清和化學定義的培養基中發展；以及由於它們的齧齒動物來源，傳播感染的風險較小。在2018年7月底之前在美國和歐盟批准的316種不同的生物製藥中，有140種（44%）是在CHO細胞中生產的。在生物製藥中，單克隆抗體（mAbs）是一個重要部分，這一事實更加明顯，考慮到84%（68種mAb產品中有57種在2018年7月底之前批准）是在CHO平臺上生產的。

傳統細胞系開發（CLD）方法依賴於轉基因的隨機整合（RI），然后通過繁瑣的篩選程序來識別穩定和高產克隆。由於整合位點不可控，RI造成的兩個主要缺點包括由於轉基因插入的異質拷貝數和位置導致的高克隆變異，以及由於轉基因拷貝數的丟失、染色體重排和表觀遺傳調控導致的生產時間克隆穩定性的降低。因此，將轉基因敲入（KI）到轉錄活躍的基因組熱點的靶向整合（TI）方法已成為一種可控和可預測的CLD方法。將轉基因精確插入所謂的基因組安全港確保了長期培養中的生產一致性和生物治療的高表達水平。這種策略還減少了克隆變異，並實現了與RI相當的生產滴度。

將感興趣的基因（GOI）引入安全港基因組位點的第一種策略是利用轉座酶和位點特異性重組酶/整合酶（SSR/SSI）。轉座子是移動的DNA片段，對於將基因高效整合到宿主細胞基因組中至關重要，無需DNA序列同源性。利用複製-粘貼或切割-粘貼機制，轉座子可以在DNA片段之間遷移。除了轉座子，它們還可以用作基因傳遞系統，並以重組蛋白或表達質粒的形式部署DNA序列。睡美人轉座子系統、Piggyback轉座子系統和Tol2轉座子系統是三個最重要的轉座子。然而，它們在自然界中被分為兩個基本亞組：I類，也稱為逆轉錄轉座子元素，以逆轉錄RNA序列的形式移動。II類，也稱為DNA轉座子，其中元素通過切割-粘貼過程通過DNA中間體進行動員。作為一類新型的整合非病毒載體，轉座系統提高了表達水平和高產克隆的比例。儘管轉座酶和SSR/SSI方法最初被提出作為靶向整合方法，但隨着特異性核酸酶（SSNs）的發展，它們現在可以被視為半靶向整合方法，因為將重組酶/整合酶的識別位點整合到宿主基因組通常是基於隨機整合。與SSNs相比，平臺（主）細胞系（PCL或MCL）的產生是利用SSR/SSI介導的轉基因整合的重要組成部分，因此在用GOI替換着陸墊（LP）之前，應該進行額外的篩選步驟，以確定具有高表達和低拷貝數的最佳克隆。這是通過測量報告蛋白的熒光強度或mAb的表達量來實現的。另一方面，與SSNs不同，由SSRs/SSRIs介導的過程不需要DNA修復途徑或宿主細胞的其他輔助因子，也不涉及DNA合成或降解。此外，SSR/SSI系統通常具有相對較低的非特異性活性，並且由於其獨特的識別位點，在特異性方面可能與SSNs相比具有優勢。需要在CHO細胞中進行整體平行研究，以比較兩個系統的特異性和效率。Phan等人對Flp重組酶和Cas9核酸酶進行了並排比較。他們建立了PCL，並通過Flp介導的盒式交換或基於Cas9的HDR介導的轉基因整合來靶向LP。他們比較研究最顯著的結果是兩種系統在靶向GOI的多個拷貝方面的差異，Cas9介導的轉基因整合優於重組酶介導的盒式交換（RMCE）。他們還提醒了圍繞單引導RNA（sgRNA）/Cas9切割位點的異常重組。總之，結合SSR/SSI和SSNs的混合策略可以從兩個系統中受益。利用CRISPR-Cas9工具進行LP的靶向整合，可以廣泛篩選，以確定要跳過的理想創始克隆。此外，一旦PCL產生，就可以反覆使用適當的重組酶/整合酶，而不需要依賴宿主細胞的修復機制的效率。

可編程核酸酶的出現，包括鋅指核酸酶（ZFN）、轉錄激活因子效應子核酸酶（TALEN）和CRISPR-Cas9為靶向基因組修飾鋪平了道路，如基因敲除（KO）、校正和插入。CRISPR-Cas9的高靶向效率、成本效益和設計的簡單性使其成為基因操作的首選。CRISPR-Cas9已廣泛用於CLD中各種基因組熱點的TI轉基因。靶向整合體顯示出過量的滴度生產、低克隆變異和高生產穩定性，縮短了CLD篩選過程。

根據效應基因的結構和功能，CRISPR-Cas系統分為兩類。I類包括I型、III型和IV型，由一個CRISPR RNA（crRNA）和由三個到六個Cas基因編碼的多亞基效應複合體組成。II類包括II型、V型和VI型系統，它們由一個單一的效應核酸酶和一個crRNA組成，在某些情況下，crRNA也與CRISPR-Cas編碼的小RNA（tracrRNA）雜交。基因組編輯技術是通過發展II類系統實現的，這些系統能夠通過不同的機制誘導基因表達的定量和定性變化，包括轉座酶介導的DNA整合、雙鏈斷裂（DSB）修復途徑、鹼基編輯和通過死亡Cas或VI型RNA編輯系統進行基因表達調節。表S1描述了不同CRISPR-Cas系統的詳細屬性，包括它們的功能、特徵蛋白、效應物、鄰近原間隔基序（PAM）序列、作用機制和切割產物。

在I型系統中，當存在PAM序列時，Cas3核酸酶由crRNA引導至目標序列，並通過切割非互補鏈產生單鏈斷裂（SSB）。在II型系統中，設計為CRISPR-Cas9基因組編輯工具，使用富G的PAM序列，sgRNA引導的Cas9通過切割目標和非目標鏈產生雙鏈斷裂（DSB），導致產生平末端切口。不同的Cas9核酸酶同源物已被表徵並重新用作基因編輯器，它們通過整體大小和PAM特異性相互區分。第一個且最被廣泛表徵的版本是S. pyogenes Cas9（SpCas9），它是一個大型核酸酶（1368個氨基酸），與其它同源物相比，具有相對寬松的PAM序列（5'-NGG-3'），這意味着它可以與更多的基因組位點相互作用，這在需要在導向RNA（gRNA）設計中具有更多靈活性時非常有用。S. aureus（SaCas9）和C. jejuni（CjCas9）的Cas9是兩個緊湊的核酸酶，能夠被包裝在腺相關病毒（AAVs）中，並用於難以轉染的細胞系。工程化Cas9核酸酶包括高保真度SpCas9（SpCas9-HF1，eSpCas9-1.1）、具有放松PAM的SpCas9（SpCas9-NG）、SpCas9切口酶（Cas9n）和無核酸酶活性的SpCas9（dCas9）。表S2描述了最常見的自然發生和工程化CRISPR核酸酶的特徵，以及它們與SpCas9相比的優缺點。在III型系統中，這是一個不依賴PAM的系統，sgRNA引導的Cas10（Csm）蛋白在每六個核苷酸處對非目標鏈產生SSB，導致形成短的核酸片段。III型被細分為四個類別（A-D），IIIA型針對mRNA，IIIB型針對DNA。IIIC和IIID型的目標仍然未知。IV型在DNA和RNA上的作用原理尚不清楚。在V型中，也使用PAM序列，Cas12a（Cpf1）效應蛋白由crRNA引導，切割目標和非目標鏈，導致產生粘性末端切口。VI型CRISPR-Cas系統，被細分為四個亞型（A-D），也由單一的效應核酸酶Cas13（以前稱為C2c2）組成。Cas13蛋白與crRNA組裝形成RNA引導的RNA靶向複合體。Cas13核酸酶包含兩種不同的核糖核酸酶活性，一種用於前crRNA處理，另一種用於順式或反式RNA目標切割。在VI型中，觀察到Cas13對3'端原間隔序列旁的第一個核苷酸的某些核苷酸有嚴格的偏好，例如A、U或C（H），而不是Lsh-Cas13a的G。這種被稱為「原間隔序列側翼序列」（PFS）而不是PAM的偏好，也已在其他Cas13酶中報道。

在這篇綜述中，討論了CRISPR介導的CHO細胞工程方法，以及不同的CRISPR供體設計策略，用於將所需的構建體TI到CHO基因組熱點中。

2. CRISPR-Cas9介導的基因KO用於細胞系工程

對大量生物製劑的需求不斷增長，需要不斷優化和開發CHO細胞系中的生產系統。因此，研究人員正在尋找更好的選擇，以增加體積容量，同時保持產品質量。這些舉措包括1.基因的過表達2.非編碼RNA介導的基因沉默3.基因KO。這些方法中的每一種都可以針對糖基化基因、細胞代謝、抗凋亡/促凋亡途徑、細胞生產力、細胞周期檢查點激酶等等。在上述提到的所有工程方法中，這篇綜述在KO工程部分的主要關注點是CRISPR介導的，這些方法幾乎全部基於基因KO研究。我們根據這一研究領域中的所有論文（代謝工程、信號通路工程、糖工程、表觀遺傳工程、酶工程、HCPs的減少和抗凋亡工程）將KO部分的文章分成更詳細的類別，並進行了討論。

2.1.  代謝工程

在連續批培養中，CHO細胞消耗大量資源，包括葡萄糖和氨基酸。然而，許多資源被轉化為代謝副產物，其中一些阻礙了細胞增殖。乳酸和氨已知是限制細胞生長和生產力的主要副產物，並且在超量時會影響糖基化模式。過去，人們採用了替代的培養方法、培養基設計和代謝工程來降低乳酸的產生。

爲了減少如乳酸和銨等抑制生長的代謝副產物的釋放，Ley等人利用中斷CHO細胞中幾種氨基酸分解途徑的生理效應。利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術，他們操縱了七個不同氨基酸分解途徑中的九個基因，包括Aass、Afmid、Ddc、Gad1、Gad2、Hpd、LOC100759874、Prodh和Prodh2。在不同條件下，破壞單個氨基酸分解基因降低了特定的乳酸和銨分泌，同時增加了特定的生長速率和活細胞密度的積分。Hpd和Gad2的破壞特別有趣，因為它們顯示出不變的氨基酸攝取速率，同時具有更高的生長速率（高達19%）、更高的活細胞密度積分（高達50%）、更低的特定銨產生量（高達26%），以及乳酸產生量的減少（較少程度，高達22%）。

氨基酸分解的副產物或中間體，特別是與支鏈氨基酸（BCAAs）相關的那些，構成了大量抑制性代謝物。在CHO細胞中，編碼催化BCAA降解的第一步的酶的支鏈氨基酸轉氨酶1（BCAT1）通過CRISPR-Cas9被敲除。在連續批培養中，這種基因的CRISPR-Cas9介導的KO完全消除了來自BCAA分解途徑的抑制性副產物的產生，如異戊酸鹽、異丁酸鹽和2-甲基丁酸鹽，從而導致細胞生長和生產力顯著增強。

2.2.信號通路工程

通過表達BMP信號轉導的關鍵元素的CHO細胞系（CHO-BMP-4）生產重組人骨形態發生蛋白-4（rhBMP-4）。這種細胞系經歷了自分泌BMP-4信號。在Kim和Lee的研究中，化學抑制劑LDN-193189顯著提高了rhBMP-4的mRNA表達水平，通過抑制CHO-BMP-4細胞中的自分泌BMP信號。使用CRISPR-Cas9基因編輯技術敲除了DG44細胞中的BMP受體、BMPRIA或BMPRII基因，以產生不受BMP信號影響的宿主細胞。使用三種不同的KO宿主細胞系和DG44野生型（WT）細胞系創建了產生rhBMP-4的rCHO細胞克隆。在批培養和連續批培養中，KO衍生的克隆顯示出比WT衍生的克隆顯著更高的最大rhBMP-4濃度。與WT衍生的克隆相比，KO宿主驅動的克隆的平均最大rhBMP-4濃度幾乎是2.4倍（p < 0.05）。

儘管強烈的mTOR活性與CHO細胞中的高生產力相關，但在實驗中也表明，雷帕黴素的抑制可以通過提高活力來增加生產力。McVey等人使用CRISPR-Cas9編輯修改CHO細胞，以強制高mTORC1活性，該活性調節對營養物質和外部生長環境的代謝活動。他們破壞了PTEN，一種抑制PI3K/AKT/mTOR途徑的磷酸酶，或TSC2，一種重要的mTOR抑制蛋白。在連續批條件下，只有在TSC2缺陷的細胞中mTORC1才被恆定激活。細胞體積增大，它們產生更多蛋白質，它們的特定生產力增加了兩倍以上。儘管峰值活細胞密度受到損害，但總體滴度與親本克隆相比達到了一定水平。

2.3.糖工程

利用遺傳工程對糖基化酶和蛋白質骨架進行改造，以在生物治療劑中添加或去除特定的糖基化位點的技術，已經從增強CHO細胞中糖基化控制的努力中出現。在哺乳動物細胞中，由FUT8基因編碼的1,6-巖藻糖基轉移酶是主要的酶，通過-1,6連接將巖藻糖轉移到N-糖苷的內層GlcNAc殘基上。抗體Fc區域上的核心巖藻糖的存在可以通過抑制抗體依賴性細胞毒性（ADCC）來降低其體內的治療效力。爲了進一步確定FUT8在CHO細胞糖基化中的作用，G. Yang, Wang等人通過CRISPR-Cas9技術創建了一個FUT8 KO CHO細胞系，並與WT CHO細胞進行了大規模糖蛋白組學的比較。FUT8的耗盡不僅影響了蛋白質核心巖藻糖基化，還影響了其他糖基化機制和蛋白質糖基化的相對丰度。Ronda等人（2014年）首次證明了CHO密碼子優化的Cas9可以用來通過破壞參與O-和N-糖基化的COSMC和FUT8基因來改變CHO細胞的基因組。CHO細胞是生物製藥行業中最常用的生產平臺。因此，產生FUT8和COSMC KO CHO細胞系，可用於生產完全非巖藻糖基化的抗體，同時ADCC功能是預期的，是有利的。

當從抗體重鏈的核心N-連接糖上去除巖藻糖分子時，ADCC（抗體依賴性細胞毒性）會增加。敲除CHO宿主細胞中的FUT8基因是生產完全非巖藻糖基化抗體的一種流行且有效的方法。然而，FUT8-KO宿主的一個重大缺點是需要進行兩次單獨的CLD工作，以產生主要巖藻糖基化和完全非巖藻糖基化的抗體種類，以便在體外和體內進行比較研究。找到主要巖藻糖基化和FUT8-KO的克隆，具有足夠的相同產品質量特徵，以確保觀察到的ADCC優勢可以嚴格歸因於非巖藻糖基化，是更加困難的。根據添加到細胞培養基中的巖藻糖量，Louie等人報告了使用CRISPR-Cas9技術創建和使用FX-KO CHO宿主細胞系，可以表達具有主要巖藻糖基化或完全非巖藻糖基化糖鏈剖面，以及其他相似產品質量屬性的抗體分子。

N-乙酰神經氨酸（NGNA），一種在單克隆抗體（mAbs）上發現的唾液酸殘基，並不被認為在CHO細胞中有相當數量的表達。NGNA唾液化水平可能因CMAH基因過度表達而上升。爲了檢驗模型細胞增強的蛋白質NGNA唾液化是由CMAH蛋白引起的假設，基因組CMAH基因位點被修改以產生催化失活版本。通過基因組敲除CMAH驗證的細胞系不再具有表面糖蛋白NGNA的唾液化。大多數具有類似人類糖基化的重組治療性糖蛋白是由使用CHO細胞的哺乳動物宿主生產的。然而，CHO細胞中由胞苷酸單磷酸N-乙酰神經氨酸羥化酶（CMAH）產生的N-乙酰神經氨酸（Neu5Gc）會刺激人類免疫系統。CRISPR-Cas9基因編輯系統被用來敲除CHO細胞中CMAH的表達。在突變的CHO細胞中表達的重組人促紅細胞生成素（rEPO），並且rEPO的糖基分析顯示G0F、G1F-GN（半乳糖化糖鏈）增加，而G0F-GN、G0、Man5（其他糖鏈）減少。

重組糖蛋白的體內半衰期和治療效果都極大地受到N-糖苷中發現的末端單糖唾液酸的影響。在連續批培養模式下生產重組人促紅細胞生成素（rhEPO）的一個重大障礙被認為是由於細胞外唾液酸酶的積累，導致rCHO細胞培養中rhEPO的唾液化水平低。爲了克服這個障礙，Ha等人最初使用CRISPR-Cas9系統敲除了三個唾液酸酶基因（Neu1、2和3）。與WT細胞相比，唾液酸酶KO克隆在連續批培養中保持了唾液酸含量和四唾液酸化rhEPO的比例，而沒有對細胞生長和rhEPO合成產生負面影響。在唾液酸酶KO克隆（5X KO克隆）中，額外敲除促凋亡基因BAK和BAX可以增強rhEPO合成，而不影響唾液化。5X KO克隆在連續批培養的第10天比WT細胞多三倍的唾液酸和1.4倍的rhEPO。此外，在連續批培養的第10天，5X KO克隆的四唾液酸化rhEPO水平為42.2%-44.3%，而WT細胞僅為2.2%。

Prabhu等人表明，改變重組IgG的糖型剖面是可能的。在表達重組IgG的CHO細胞中，他們使用CRISPR-Cas9工程化了核苷酸糖合成途徑，以組合控制半乳糖化和巖藻糖化。當酶UDP-半乳糖4'-表異構酶（Gale）和GDP-L-巖藻糖合酶（FX）被敲除時，UDP-Gal和GDP-Fuc的合成被抑制。在雙KO細胞系中，半乳糖化和巖藻糖化完全依賴於挽救途徑，允許通過管理細胞外半乳糖和巖藻糖的可用性來調節UDP-Gal和GDP-Fuc的產生和細胞內核苷酸糖的可用性。半乳糖化和巖藻糖化水平可以同時獨立控制，只需改變細胞外半乳糖和/或巖藻糖的可用性。這種修改的CHO宿主平臺可以促進快速合成不同糖工程蛋白，以評估生物活性，並實現特定糖型的生產。

通過結合CRISPR干擾（CRISPRi）介導的糖酶敲低和隨后的基於凝集素的FACS介導的選擇（lectin-FACS），K. Glinšek在CHO細胞系糖工程中調查了一種新策略。他們檢驗了CRISPRi改變FUT8基因表達的潛力。在這個探索性研究中，爲了改變CHO細胞內源基因表達，轉錄抑制域KRAB被融合到催化失活的Cas9（KRAB-dCas9）上。通過將CRISPRi技術與凝集素-FACS分選結合，內源基因參與巖藻糖化被下調，結果，產生低水平巖藻糖化的CHO細胞進一步富集。

使用死Cas9（dCas9）的CRISPRa用於增加內源基因轉錄，擴展了CRISPR工程工具箱。Karottki等人選擇了Mgat3和St6gal1，這兩種沉默的糖基轉移酶在CHO細胞中不表達，但它們的表達將允許生產更類似人類的糖鏈結構。他們能夠觸發並增強Mgat3和St6gal1的轉錄，並通過識別適當產生的糖鏈結構在功能水平上得到驗證。因此，根據這項研究，CRISPRa可以修改CHO細胞以獲得特定表型。

2.4.表觀遺傳工程

基因拷貝數的逐漸丟失導致轉錄沉默，因此轉錄本減少，可能是轉基因表達水平下降的原因之一。使用CRISPR-Cas9破壞編碼DNA甲基轉移酶的Dnmt3a基因，可以增加CMV啟動子下轉基因表達的穩定性，持續60次傳代以上。Dnmt3a缺陷細胞顯示出顯著更高的轉基因表達以及更低的啟動子和全基因組DNA甲基化率。

此外，研究人員在CHO細胞中部署靶向表觀遺傳編輯工具，作為一種替代工程技術，在不影響基因組序列的情況下開關基因。例如，Marx等人使用dCas9激活當前沉默的β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶1（ST6GAL1）基因，通過將Ten-Eleven Translocation甲基胞嘧啶雙加氧酶1（TET1）的催化域（CD）靶向其甲基化啟動子。在80多天的時間里，超過60%的轉染細胞實現了穩定的上調。激活和對照培養物之間在生長或重組蛋白生產方面沒有差異。

CHO細胞表達系統開發最常見的障礙之一是連續培養中重組蛋白表達的不穩定性。人們認為，由Dnmt3a、Dnmt3b和維持DNA甲基化的酶Dnmt1介導的DNA甲基化在CHO細胞中轉基因表達的不穩定性中起着關鍵作用。已經發現，基因表達的調控與Dnmt3b介導的表觀遺傳修飾更強烈地相關。因此，在Feng等人的研究中，使用CRISPR-Cas9基因組編輯技術敲除了Dnmt3b基因，以創建Dnmt3b基因缺陷的CHO細胞。根據發現，與正常轉染的CHO細胞相比，Dnmt3b KO CHO細胞在30次傳代以上的增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的長期穩定性增加了。此外，他們發現轉基因Dnmt3b KO CHO細胞表達的重組人纖維連接蛋白（VN）和單克隆抗體至少比正常CHO細胞產生的多1.6倍。

2.5.酶工程

細胞生產力直接影響生產成本。爲了找到影響分泌重組蛋白產生的新基因靶標，沒有大規模的CHO特異性功能篩選可用。在這里，Lin等人開展了大規模的、CHO細胞特異性的小干擾RNA（siRNA）篩選，以尋找一致增加抗體產生的基因。在重組CHO細胞系中，發現了四個基因（Cyp1a2、Atp5s、Dgki和P3h2），並隨后選擇了CRISPR-Cas9 KO評估。Cyp1a2、Atp5s或Dgki的單一敲除使特定抗體的生產力增加了90%以上，但P3h2沒有。總體而言，Cyp1a2的刪除在抗體生產中顯示出顯著的改善，對細胞增殖的影響最小。

外源基因的隨機整合需要多輪篩選和選擇，可能導致位置效應和基因沉默，使得生成穩定、高產的細胞系變得具有挑戰性。特異性整合（SSI）方法可能能夠解決RI的問題，但其適用性受到其極低效率的限制。最近，通過抑制DNA連接酶IV（LIG4）活性，提高了額外哺乳動物細胞類型中SSI效率，這對於NHEJ修復系統至關重要。然而，這種策略尚未在CHO細胞中測試。在本文中，Wang等人使用CRISPR-Cas9介導的基因組編輯從CHO細胞中移除LIG4基因。值得注意的是，在ROSA26位點的精確控制下，LIG4-CHO細胞中SSI效率顯著提高了9.2倍，而RI效率很可能由CHO中的NHEJ介導，被LIG4 KO阻礙。此外，CHO細胞的增殖不受LIG4消融的影響。

無血清介質中CHO細胞的懸浮培養已適應工業合成治療蛋白。爲了快速工程化CHO細胞以適應懸浮培養，N. Lee等人使用特定鏈的RNA-Seq發現基於它們在無血清介質中隨時間變化的表達模式差異的基因。根據適應軌跡，他們發現了顯著下調的基因，並隨后使用基因組編輯技術確認它們的效果。Igfbp4和AqpI基因的功能刪除加速了CHO-K1細胞的懸浮適應，根據基於生長的篩選和靶向擴增子測序。使用無DNA的RNA引導的Cas9核酸酶技術和特定鏈的轉錄組測序，更容易合理設計CHO細胞基因組，以有效生產高質量的治療蛋白。

張等人建立了基於雙缺陷的CHO-K1的新選擇方法。他們使用CRISPR-Cas9敲除了編碼催化嘧啶和嘌呤合成最后兩個步驟的雙功能酶（尿苷酸合酶和5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸甲酰轉移酶/IMP環水解酶（ATIC））的基因。這些雙缺陷細胞的生存需要嘌呤和嘧啶來源的供應或編碼這兩種酶的開放閲讀框的轉染和整合。他們能夠使用這些雙缺陷細胞之一（UA 10）選擇穩定的轉染體，包含抗Her2單克隆抗體曲妥珠單抗和重組腫瘤壞死因子受體融合蛋白依那西普的重鏈和輕鏈。這些重組蛋白在轉染體克隆中以穩定的方式大量產生。在另一個實驗中，張等人在CHO-K1細胞中開發的多缺陷型CHO8A中刪除了嘌呤/嘧啶生物合成途徑中的八個酶階段。通過轉染補體DNA基因為這八個缺失的功能，恢復了原養性。后者是通過同時使用八個載體來完成的，每個載體都攜帶一個貨物蛋白的基因和一個八個救援基因中的一個。從篩選中僅十個存活的菌落中，發現分泌單克隆抗體的高產生產者，每細胞每天高達84皮克。

細胞培養生產過程中存在的內源性羧肽酶被認為負責治療性單克隆抗體中常見的C末端賴氨酸水平的異質性。本研究使用用於生產治療性抗體的CHOK1宿主和每個宿主產生的表達抗體的細胞系，通過qRT-PCR分析檢測了五種羧肽酶CpD、CpM、CpN、CpB和CpE的表達。根據本文，CpD顯示出最高水平的mRNA表達。通過RNAi（RNA干擾）技術降低CpD mRNA水平時，C末端賴氨酸水平增加。最重要的是，質譜分析顯示，使用CRISPR技術敲除CpD表達時，C末端賴氨酸切割在CpD KO細胞中被完全消除，證明CpD是CHO細胞中唯一切割抗體重鏈賴氨酸的內源性羧肽酶。

Shen等人是第一批指出CRISPRi可以被利用來增加CHO細胞中重組蛋白生產的研究人員，最終為CHO細胞工程開闢了新的道路。在這個實驗中，作者開發了攜帶功能性CRISPRi系統的載體，證明了CRISPRi介導的DHFR轉錄成功抑制。之后，他們產生了穩定表達DHFR、模型蛋白（EGFP）、dCas9和針對DHFR的gRNA的CHO細胞克隆。結合甲氨蝶呤（MTX）選擇，CRISPRi介導的DHFR抑制對CHO細胞施加了額外的選擇壓力，迫使它們共同放大更多DHFR和EGFP基因的拷貝。與傳統的MTX選擇（高達250 nM）相比，CRISPRi方法將DHFR拷貝數提高了3倍，EGFP拷貝數提高了3.6倍，EGFP表達提高了3.8倍，而不影響細胞生長。他們還將CRISPRi方法應用於增加粒細胞集落刺激因子（G-CSF）的產量，提高了2.3倍。

在CHO細胞中生產的重組HIV包膜蛋白gp120在關鍵表位處被絲氨酸蛋白酶蛋白水解切割。補體成分1s（C1s），補體級聯反應中的絲氨酸蛋白酶，在S. W. Li等人的研究中被確定為CHO細胞中gp120蛋白水解的酶。在CHO細胞系中，CRISPR-Cas9介導的C1s蛋白酶的刪除消除了對重組生產的gp120的蛋白水解活性。此外，C1s蛋白酶和MGAT糖基轉移酶敲除細胞，允許生產未切割的gp120，具有豐富的甘露糖5糖鏈模式。絲氨酸蛋白酶KO細胞系被證明對重組合成的病毒蛋白沒有蛋白水解活性，為生產其他易受蛋白水解的蛋白質鋪平了道路。

2.6.降低HCPs

研究人員報告了通過中斷幾個基因並去除宿主細胞蛋白（HCPs）來建立和工程化「清潔」CHO細胞的步驟。他們證明了有針對性的基因組編輯，協調組學研究，可能導致HCP含量顯著降低。研究人員開發了基於系統生物學的計算機模型，以説明去除多個HCP可以釋放大量能量，然后使用蛋白質組學在多重CRISPR-Cas9破壞多達14個編碼蛋白的基因之前識別目標HCP，這些蛋白在CHO收穫的細胞培養液（HCCF）中豐富，難以去除（DTR）或對產品質量產生有害影響。他們觀察了6個蛋白質（大粒蛋白[BGN]、半乳糖凝集素-3結合蛋白[LGALS3BP]、Nidogen-1 [NID1.1和NID1.2]、組織蛋白酶D[CTSD]）、11個蛋白質（N(4)-(β-N-乙酰葡糖胺)-L-天冬醯胺酶[Aga]、內質網駐留蛋白29[Erp29]、G蛋白偶聯受體56[Gpr56]、腎小管間質性腎炎抗原樣[Tinagl1]和半胱氨酸蛋白酶[Lgmn]）以及14個蛋白質（編碼YEATS結構域蛋白2[Yeats2]、SPARC[Sparc]和脂蛋白脂肪酶[Lpl]的基因）的HCP含量。他們發現敲除細胞系的HCP含量分別減少了40%、60%-70%和60%-70%。根據細胞系和生長設置，還檢測到增加的利妥昔單抗（Rit）產量和改善的生長特性。與6x KO Rit細胞系的mAb/HCP比率提高了7倍，11x KO后提高了2倍，導致產品純度顯著提高。在另一項研究中，Dovgan等人證明了穩定的短發夾RNAi或使用CRISPR-Cas9的單等位基因刪除目標基因足以顯著降低mAb產生細胞系中共純化的HCP水平，即使適度下調（50%）難以去除的組織蛋白酶D。這足以將組織蛋白酶D酶活性降低到可忽略的水平，防止強制降解研究中的mAb片段化，並降低質譜檢測的蛋白A純化樣品中組織蛋白酶D雜質水平，從而提高產品質量。

被確定為下游處理中可能保留的10個HCPs之一的是脂蛋白脂肪酶（LPL），它水解甘油三酯中的酯。由於Polysorbates和甘油三酯在結構上的相似性，LPL可能降解最終產品配方中的聚山道醇80（PS-80）和聚山道醇20（PS-20）。因此，也創建了一個缺乏LPL活性的細胞系。LPL表達被廢除，由於有針對性的突變，聚山道醇降解被抑制，而不影響細胞活性。CHO-K1 LPL KOs顯示LPL表達減少了95%以上，聚山道醇降解減少了41-57%，同時保持了生物製藥處理所需的特性。

雖然標準下游純化方法充分去除了大部分HCP污染物，但清除一小部分HCP仍然很困難。研究人員評估了通過敲除Anxa2和Ctsd基因來降低HCP污染風險的KO技術的可行性。使用CRISPR-Cas9方法有效地創建了Anxa2-和Ctsd-KO CHO細胞系，作者證實細胞裂解液中相關HCP的完全去除。重要的是，所有突變細胞系在培養8天后的生長和存活與WT對照相似。

2.7.抗凋亡工程

在蛋白質生產過程中由細胞應激引起的凋亡是限制CHO細胞生產力的障礙。科學家利用CRISPRi抑制CHO細胞中凋亡基因BAK、BAX和Casp3的內源性表達。除了減少凋亡外，線粒體膜完整性得到改善，半胱氨酸蛋白酶活性降低。CRISPRi還可以減少凋亡表型，並且活細胞密度（VCD）也有輕微但顯著的增加。

Grav等人在CHO細胞中使用多重設置來展示CRISPR-Cas9基因組編輯的適用性和有效性，通過同時破壞作為糖工程的巖藻糖基轉移酶基因FUT8以及作為促凋亡基因的BAK和BAX。與野生型CHO-S細胞相比，突變細胞系顯示出更好的抗凋亡能力。與CRISPR-Cas9結合的多重編輯可以進一步加速CHO細胞中的基因組工程。與抑制凋亡一致，含有BAK和BAX基因突變的三重和雙重KO細胞系觀察到活力下降的延迟，導致更長的培養壽命。使用VCL和利妥昔單抗生產確定了五種細胞系的生產力。雙KO和兩個三重KO細胞系的利妥昔單抗生產與野生型CHO-S細胞相當，甚至對兩個克隆更好。

增加的細胞密度經常導致凋亡細胞死亡。抗凋亡CHO細胞系可能提供一種減少加強生產程序中不良結果的方法。開發並評估了表達常見和雙特異性抗體的BAX/BAK雙KO（DKO）抗凋亡宿主。除了提高活力外，從BAX/BAK DKO宿主衍生的克隆或羣體表達的治療蛋白也允許在14天強化生產過程的最后階段增加生產力。BAX/BAK DKO和WT細胞產生的化合物具有相同的產品質量。

MacDonald等人使用CRISPR-Cas9工程化BCL-2家族的三個衆所周知的效應蛋白：BAK1、BAX和BOK的組合KO。研究結果證實了BAK1和BAX的協同抗凋亡特性，而BOK的喪失沒有明顯影響。細胞死亡可以通過KO的BAK1和BAX準確觀察和建模，而無需特定數量化的細胞內組分，並且被延迟和延緩。BOK似乎對CHO細胞培養的表現沒有影響。

另一項研究開發了一種CHO細胞系，可以在無血清培養中適應，同時穩定表達英夫利昔單抗。使用CRISPR-Cas9基因組編輯方法，破壞了凋亡途徑的關鍵調節因子Bcl-2拮抗劑/殺手1（BAK1），並將英夫利昔單抗編碼片段插入CHO染色體的BAK1位點。在基因組編輯的細胞中，血清飢餓激活對BAK1和細胞色素C（CytC）的影響被抑制，細胞維持血清飢餓誘導的線粒體膜電位喪失和凋亡的能力增強。通過連續傳代，可以在基因組編輯的CHO細胞中穩定生產英夫利昔單抗。

Shen等人表明CRISPR-Cas13d通過瞬時轉染有效地抑制了CHO細胞中外源基因以及參與基因擴增、凋亡、代謝和糖基化（例如GS、BAK、BAX、PDK1和FUT8）的許多內源基因的表達，效率在60%到80%之間。他們通過將完整的CRISPR-Cas13d系統與睡美人轉座子系統以及最佳gRNA設計相結合，提高了敲低效率，並迅速產生了敲低80-90%的穩定細胞。他們使用這種方法大幅減少了IgG巖藻糖化，超過90%的FUT8表達。Orlova等人同時使用Cas9酶編輯CHO S細胞的四個基因（dhfr、glul、BAX和BAK1），每個基因使用一個最優的gRNA，以加快修改克隆的選擇。可以使用四種gRNA在多重方法中改變CHO細胞基因組，允許敲除八個目標等位基因中的七個。

另一項最新研究報告了使用CRISPR-Cas9消除miR-744以增加CHO細胞生產力。在癌細胞中，miR-744可能具有促凋亡特性。此外，MiR-744被確定為先前高含量miRNA篩選中生產力下降的可能靶標。因此，兩個sgRNA Cas9介導的DNA DSBs環繞miR-744位點並去除了基因組miR-744前體序列。與非靶向（NT）sgRNA轉染的克隆對照的156 mg/L相比，miR-744 KOs在批培養期間的抗體滴度要高得多，範圍在190到311 mg/L之間，表明miRNA KO對細胞系工程的前景。

大多數使用KI策略的CHO細胞工程研究都是基於將重組蛋白編碼基因引入熱點，而CRISPR介導的KI方法在CHO細胞工程中很少見。Wang等人使用CRISPR-Cas9通過精確編輯兩個基因來增強CHO-K1細胞的異源蛋白生產能力，加強ER微環境並增強抗凋亡能力。重組CHO細胞中外源GOI的表達通常由病毒啟動子驅動，對內質網（ER）施加巨大壓力，任何刺激，如代謝應激引起的缺氧，都可以破壞ER蛋白質穩態，觸發ER中的未摺疊蛋白反應（UPR）導致細胞凋亡。爲了打破重組蛋白生產的瓶頸，他們選擇quiescin-sulfhydryl oxidase1（QSOX1）和抑制凋亡蛋白（IAP）；Survivin，來操縱蛋白質二硫鍵形成過程和細胞凋亡途徑，促進ER中的蛋白質處理能力並增強CHO細胞的壽命。結果，修改的CHO-K1細胞的抗凋亡活性增加了6.40倍，生產產量提高了5.55倍。

表1概述了關於CRISPR介導的CHO基因組工程的最重要研究。據我們所知，本節中考慮的所有CRISPR/Cas9介導的KO出版物都適合上述一個類別。在未來的CLD研究中，這些方法的組合可能被用來開發細胞系，這些細胞系不僅具有提高的活力和蛋白質生產力，同時還進行適當的糖基化，同時沒有任何副產物。此外，通過使用CRISPRi/a等最新技術，可以想象生成細胞系，其中所需基因的表達根據CLD的目標進行調整。

3.CHO細胞中的轉錄活躍位點（熱點）

傳統穩定的細胞系開發（CLD）程序中廣泛使用了隨機整合（RI）方法。然而，這種方法中，目標基因可能被整合到異染色質或染色質的不穩定區域，需要重複多輪篩選以獲得具有穩定目標蛋白表達水平的可接受表達細胞系。此外，由隨機整合細胞系生產的蛋白質存在相當大的序列變異度，這可能歸因於選擇高生產者克隆所用選擇劑的誘變性。

隨着基因組工程的發展，正在研究一種新的細胞系生產方法，特別是將轉基因整合到宿主細胞基因組的特定位點。爲了成功的轉基因敲入（KI）和表達，需要一個「安全港」基因組區域或「熱點」，並且識別新的功能性熱點對於這種新的細胞系生成過程至關重要。此外，對於重組蛋白、藥物等的大規模基因組工程，需要能夠精確有效地將大量外源DNA整合到允許轉基因表達的基因組位點，並且創新的特異性整合（SSI）方法如鋅指核酸酶（ZFN）、TALEN、重組酶介導的盒式交換（RMCE）以及特別是CRISPR-Cas9技術的成功依賴於事先了解轉基因整合的理想位點。

表1 CRISPR-Cas9在CHO細胞工程中的應用

1 中國倉鼠卵巢。2 雙重基因敲除。3 對草快（1,1'-二甲基-4,4'-聯吡啶二氯化物），一種廣泛使用的除草劑。4 8-氧化鳥嘌呤DNA糖基化酶。5 參與8-氧化鳥嘌呤（8OG）鹼基切除修復的兩個關鍵酶。6 活性氧種類。7 8-氧鳥嘌呤。8 雙鏈斷裂。9 基因敲除。10 宿主細胞蛋白。11 膜聯蛋白A2。12 組織蛋白酶D。13 鈣網蛋白。14 整合活細胞密度。15 基因敲除。16 丁酸鈉。17 DNA甲基轉移酶。18 鉅細胞病毒。19 增強型綠色熒光蛋白。20 活細胞密度。21 單細胞克隆2。22 α1,6-巖藻糖基轉移酶。23 第1組分。24 甘露糖α-1,3-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺基轉移酶。25 未剪切的HIV-1 gp120來自B型分離株。26 小時。27 脂蛋白脂肪酶。28 插入/缺失。29 支鏈氨基酸。30 支鏈氨基酸轉氨酶1。31 金屬蛋白酶抑制劑1。32 大粒蛋白。33 半乳糖凝集素-3結合蛋白。34 Nidogen-1。35 組織蛋白酶D。36 N(4)-(β-N-乙酰葡糖胺)-L-天冬醯胺酶。37 內質網駐留蛋白29。38 G蛋白偶聯受體56。39 腎小管間質性腎炎抗原樣。40 半胱氨酸蛋白酶。41 活細胞密度。42 三重基因敲除。43 巖藻糖基轉移酶8。44 Bcl-2同源拮抗劑/殺手。45 Bcl-2相關X蛋白。46 氨基酸。47 4-羥基苯丙酮酸雙加氧酶。48 谷氨酸脱羧酶2。49 乳酸脱氫酶a。50 三羧酸循環。51 丙酮酸激酶肌肉同工型1和2。52 活細胞計數。53 β-1,4-半乳糖基轉移酶。54 抗體依賴性細胞毒性。55 促紅細胞生成素。56 GDP-巖藻糖轉運蛋白基因。57 促紅細胞生成素與恆定片段的融合。58 α-2,3-唾液酸轉移酶。59 半乳糖基轉移酶。60 死亡Cas9與Ten-Eleven Translocation甲基胞嘧啶雙加氧酶的融合。61 死亡Cas9與DNMT3A3的催化域的融合。62 死亡Cas9與DNMT3A3L的催化域的融合。63 組蛋白3的乙酰化賴氨酸27。一種可選擇性異染色質的組蛋白修飾標記。64 組蛋白3的賴氨酸4三甲基化。65 組蛋白3的賴氨酸4三甲基化。66 CRISPR激活。67 感興趣基因。68 β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶1。69 醛脱氫酶18家族成員A1。70 骨形態發生蛋白-4。71 重組人BMP。72 BMP受體類型IA。73 BMP受體類型II。74 整合活細胞濃度。75 胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)域和甲狀腺球蛋白類型-I域。76 水通道蛋白（分子水通道蛋白）。77 雙基因敲除。78 谷氨醯胺合成酶。79 Bcl-2同源拮抗劑/殺手。80 Bcl-2相關X蛋白。81 丙酮酸脱氫酶激酶1。82 α-1,6-巖藻糖基轉移酶。83 ST6 β-半乳糖苷α-2,6。84 哺乳動物雷帕黴素靶蛋白複合體1或機械靶蛋白複合體1。85 磷脂酰肌醇3-激酶。86 結節性硬化症複合體。87 磷酸酶和張力蛋白同源物。88 內質網。89 線粒體。90 尿苷酸合酶。91 5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸甲酰轉移酶和/或IMP環水解酶。92 補充100 μM尿苷且不含次黃嘌呤的培養基。93 UDP-半乳糖4'-表異構酶。94 GDP-L-巖藻糖合酶。95 野生型。96 特定生產力。97 胞苷酸單磷酸N-乙酰神經氨酸羥化酶。98 N-乙酰神經氨酸。99 胞苷酸單磷酸N-乙酰神經氨酸羥化酶的敲除。100 N-乙酰神經氨酸。101 N-乙酰神經氨酸酸。102 重組人促紅細胞生成素。103 Bcl-2拮抗劑/殺手1。104 羧肽酶D。105 特異性整合。106 隨機整合。107 DNA連接酶IV。

不同的方法，如基於慢病毒的隨機整合（RI）、剪切粘貼程序，以及生物信息學工具等，可以用來在CHO細胞中識別新的熱點以應用於特異性整合（SSI）應用。雖然將目的基因（GOI）定向到穩定的熱點區域似乎有益，但識別這些熱點可能比較棘手。公開可用的穩定熱點信息並不常見，很可能是因為商業價值的考慮；儘管如此，我們在表2中列出了迄今為止從不同CHO細胞類型基因組中獲得的大多數已確認的熱點。

4.供體設計方法

CRISPR-Cas9介導的敲入（KI）迄今為止已在細胞系開發（CLD）方法中實施，以將GOI整合到預定的基因組區域。這通常通過使用含有GOI的質粒修復模板來完成，該模板由長的同源臂（HAs）所環繞。作為CHO細胞中的一項里程碑式研究，Lee等人報道了使用基於質粒的供體實現高效基因整合到三個不同的基因組位點，該供體包含熒光報告基因和新黴素選擇標記。在另一項治療生產方法中，一個完整的抗體表達盒（貝伐單抗）被整合到CHO的熱點位點，儘管與之前實驗相比效率相對較低（1.35%）。另外，通過優化CRISPR-Cas9程序（例如，評估不同的sgRNAs並實現高轉染效率），Pourtabatabaei等人實現了在CHO-K1細胞系中靶向1.8 kb基因盒的高整合率。熒光富集也是用來提高KI效率的另一個技巧。

表2 不同類型CHO細胞系中的轉錄活躍位點（熱點）

現在已廣泛認識到，基於質粒的整合背后的分子機制是同源定向修復（HDR），它精確執行基因整合，而不在基因-轉基因邊界處產生任何錯誤的插入和刪除（indels）。然而，HDR在某些細胞中效率不高，例如CHO細胞系，HDR事件的程度很低。在不使用抗生素選擇的供體中，這種低效率更加明顯。這在工業目標中尤其重要，因為由於對細胞的額外代謝負擔和生產成本的增加，不期望使用抗生素標記。

最近，供體線性化方法通過體外或體內切割供體外的轉基因或HAs，為提高多種細胞中CRISPR-Cas9介導的KI效率鋪平了道路。正如以下各節所詳述的，這些類型的供體，如HITI（同源非依賴靶向插入）（圖2a）和PITCh（精確整合到目標染色體）（圖2b），使用末端連接（EJ）修復途徑，包括非同源末端連接（NHEJ）和微同源介導的末端連接（MMEJ），分別。這些途徑被稱為HDR的優越競爭者，它們更有效地介導TI。除此之外，某些額外的設計技術，如同源介導的末端連接（HMEJ）（圖2c）和Tild，將傳統的基於HDR的供體從長HAs線性化，結合了NHEJ的高效率與HDR途徑的高精度。

4.1.體外線性化

通過聚合酶鏈反應（PCR）方法使用同源臂特異性引物或限制性酶對傳統的長同源臂供體進行體外線性化，構建一個不包含任何非同源序列的供體，可以顯著提高不同長度轉基因的敲入（KI）效率（見圖1）。最近，一種稱為Tild-CRISPR（targeted integration with linearized dsDNA-CRISPR，線性雙鏈DNA-CRISPR定向整合）的方法證明了體外切割包含0.8-6 kb轉基因、兩側各有800 bp同源臂的供體載體，可以比基於HDR的供體載體在小鼠的體外/體內基因組編輯中獲得更高的KI效率（高達12倍）。

有趣的是，在另一項工作中，當同源臂的大小從約500 bp減少到33 bp時，靶向綠色熒光蛋白（GFP）報告基因到HEK293細胞的不同位點的KI效率得以保持。值得注意的是，KI率取決於插入片段的大小；隨着它的增加，效率可能會降低。

體外切割方法也被用於T細胞工程的測試，通過向T細胞受體（TCR）位點添加一個1.5 kb線性化DNA盒（包含300 bp同源臂）。這表明，這種類型的供體的編輯率主要是通過結合依賴同源的路徑（即HDR）與高效的非同源依賴的（即NHEJ）程序來實現的。然而，由於容易出錯的NHEJ路徑在這種類型的供體編輯中扮演了關鍵角色，因此在位點-同源臂連接處可能產生隨機的插入和缺失，儘管與基於NHEJ的供體相比，發生率較低，如下面進一步詳述。因此，爲了避免可能的移碼，應當執行精確的轉基因設計，特別是當轉基因與內源基因融合時（即基因標記）。

與質粒供體相比，線性供體由於自由末端，在整合前更容易受到細胞核酸酶的攻擊。同時，研究發現，用耐核酸酶的磷酸硫酯修飾線性供體末端可以提高ZFN介導的基因組編輯中的KI頻率和插入保真度。據我們所知，這在CRISPR-Cas9系統中尚未經過測試。

圖1 利用具有同源臂（HAs）特異性的引物或限制性酶的聚合酶鏈反應（PCR）體外切割含有長同源臂的轉基因，以構建不含任何非同源序列的供體。

儘管通過將供體連接到sgRNA或Cas9內切核酸酶以增加轉基因濃度到核中已被廣泛認識可以提高基於CRISPR的KI效率，但這種方法主要適用於使用單鏈寡核苷酸（ssODNs）向基因組中插入少量核苷酸。最近，通過使用含有長同源臂的線性供體來提高大型轉基因KI的繫繩方法進行了評估。2018年，一組研究人員利用鏈黴親和素和生物素之間的高親和力，在小鼠中通過應用生物素化供體和鏈黴親和素融合Cas9蛋白實現了更高的靶向效率（高達95%）。

4.2.體內切割供體設計策略

體內切割策略利用Cas9內切核酸酶在轉基因兩側進行切割，同時在基因組目標區域提供雙鏈斷裂（DSB）。此外，供體DNA包含由sgRNA目標位點所環繞的轉基因，導致DNA線性化。這一類包括三種現成可用的策略：(i) 基於微同源介導的末端連接（MMEJ）的CRISPR-Cas9介導的PITCh（CRIS-PITCh），(ii) HMEJ，和(iii) HITI系統。在HMEJ和PITCh供體設計中，sgRNA目標位點位於同源臂的外部分，而在基於HITI的設計中，sgRNA目標區域精確定位在模板之后，全部沒有同源臂（圖2a）。

根據最近的文章，體內線性化供體已被證明可以提高KI效率。根據Zhang等人的體內實驗，線性化供體載體，即使是短至300 bp的同源臂，也相對於環狀DNA顯著提高了CRISPR-Cas9介導的HDR。此外，這種方法不僅提高了KI效率，還減少了對延長同源臂的需求。然而，應該強調的是，使用線性供體可能會增加NHEJ介導的插入，除了主要的KI機制。

MMEJ是替代NHEJ（aNHEJ）的一個亞型，當發生DSB時，它作為一個替代的修復途徑。當HR或NHEJ不足時，這種修復機制至關重要，但它也可能在HR可用時被使用。在分子途徑方面，MMEJ類似於單鏈退火（SSA）（圖2b,c），兩者都涉及退火側翼重複序列以修復DSB。替代末端連接（Alt-EJ）或MMEJ也被稱為微SSA。

Nakade等人在2014年引入了基於MMEJ介導的PITCh系統。他們將這種方法作為TALEN和CRISPR-Cas9系統中的替代基因KI策略。CRIS-PITCh系統利用MMEJ而不是HR或NHEJ，通過極短的微同源臂（20-40 bp）進行轉基因KI（圖2b）。這種短的微同源可能很容易被PCR或合成寡核苷酸插入到供體載體中。由於其能力，PITCh系統是最常見的KI系統之一，它可以在各種細胞和生物體中以無骨架、方向導向和非突變的方式整合大型基因盒，並且可以輕松構建獨特的供體載體。因此，體內線性化的CRISPR供體首次被使用，並證明了CRIS-PITCh系統可能適用於人類和動物細胞，特別是在HR率低的細胞中進行基因KI的挑戰。此外，CRISPR-Cas9中依賴MMEJ的TI作為穩健的KI方法，在體內被測試用於修復肝細胞中的Fah突變，挽救了Fah突變動物的死亡。

對於基於HMEJ的KI，需要相對長的同源臂（約800 bp）的體內線性化轉基因。爲了提供更好的結果，這種技術也可以與HDR、SSA和基於NHEJ的KI相結合。HMEJ最初被探索以確定非分裂細胞中HR供體切割是否可以提高目標基因整合。在培養的細胞、動物胚胎和體內組織中，CRISPR介導的HMEJ展示了相當大的KI效率。應該強調的是，同源臂長度也對KI效率有影響，800和1600 bp的同源臂比200和400 bp的同源臂展示了更好的KI效率。

在NHEJ介導的或非同源依賴的KI（即HITI）期間，DNA末端在DSB現場被酶處理，經常在轉基因整合后誘導一些插入和缺失；然而，與HDR不同，HITI可以在非分裂細胞中進行，無需使用同源臂。此外，基於NHEJ的KI可能以相似的頻率在各種方向（正向或反向）捕獲線性化供體。

包括NU7026在內的NHEJ抑制劑已被證明可以限制HITI效率，證明這種方法是基於NHEJ修復途徑的。Suzuki等人使用這種方法將GFP整合到非分裂細胞的神經元基因組中，人類胚胎干細胞，並在體內實驗（活體齧齒動物和成年小鼠大腦的視覺皮層）。他們發現HITI具有可接受的KI效率。此外，CRISPR-Cas9介導的HITI和HDR介導的KI在HEK293T細胞中相互比較，用於在AAVS1位點整合大型DNA供體（6.4 kb），發現HITI在正確整合大型供體方面具有更高的效率（大約3倍增加）。

5.CRISPR-Cas9與特異性重組酶的結合（混合方法）

5.1.單盒式整合

在過去二十年中，重組酶介導的轉基因整合已被用於重組細胞系開發（CLD）。在2002年的一項最早研究中，Kito等人使用Cre/loxP系統對CHO細胞系進行工程化，以獲得高產細胞。這種策略需要建立一個帶有重組酶靶位點（RTSs）和選擇標記的平臺主細胞系（MCL）。

圖2 不同的體內切割方法學。(a) 同源非依賴性靶向整合（HITI）系統。(b) 基於微同源介導的末端連接（MMEJ）的精確整合到目標染色體（PITCh）。(c) 同源介導的末端連接（HMEJ），包括同源重組（HR）和單鏈退火（SSA）途徑。在HR過程中，RAD51促進同源配對和鏈交換，而RAD52在SSA途徑中促進互補單鏈DNA分子的退火。

這一類技術中更高級的技術，RMCE，可以精確替換LP為含有目的基因（GOI）的供體載體（有效載荷向量）。RMCE平臺的生成最初基於LP在宿主基因組中的隨機整合（RI）。Pfizer的CLD小組的Inniss等人最近提出了一種混合方法，將CRISPR-Cas9與特異性重組酶結合使用（LP的TI）進行CLD。這種混合技術后來被幾個CHO社區用於多種目的。雖然整合RTS是LP設計的基本要求，但其他方法已被應用，以允許有效選擇在預定位點攜帶LP的細胞，並在適當的RMCE下富集細胞。這些策略包括正選擇，利用報告基因的細胞分選，或兩者的結合，通常通過包括單純皰疹病毒-1胸苷激酶（HSV-TK）基因的負選擇，啟動子陷阱和聚A陷阱或兩者的結合。在接下來的部分，我們將看到採用各種LPs和供體設計的研究，這些研究採用了混合策略。圖3還說明了用於開發創新LP設計的不同策略。

2017年，Inniss等人使用CRISPR-Cas9將Bxb1/attP和Flp/FRT RMCE LPs整合到CHO-S基因組的FER1L4位點，分別建立Bxb1和Flp RMCE能力的PCL。在每個RMCE系統中，LP攜帶TK和GFP盒，這些盒在單獨的啟動子下，與包含無啟動子的博來黴素抗性基因和表達IgG重鏈（HC）和輕鏈（LC）的基因的傳入重新靶向向量進行交換。通過在他們的LP中包含熒光標記，並且沒有抗生素選擇，實現了RMCE的高效富集和克隆細胞，目標整合率達到27%。在正確的RMCE情況下，預計無啟動子的博來黴素抗性基因（blaR）將在EF1α啟動子下表達，該啟動子已位於LP的5'端之外（啟動子陷阱）。RMCE后，Flp/FRT和Bxb1/attP RMCE系統的靶向整合率分別報告為67%和92%。

2018年，Grav等人採用混合（組合）方法，以減少他們比較分析中的克隆變異。爲了評估不同轉基因對細胞轉錄組的影響，他們生成了包含loxP位點的同源CHO-S細胞系，這些位點環繞着mCherry盒及其啟動子和聚A信號在lox位點之外（啟動子陷阱和聚A陷阱）。從這項研究中可以得出的結論是，如果不開發MCL，就不清楚轉錄變化是由轉基因表達還是克隆變異引起的，強調了混合技術的重要應用。

2019年，Chi等人介紹了TARGATT系統，該系統利用phiC31整合酶和CRISPR-Cas9的組合進行SSI。他們使用CRISPR-Cas9將他們的LP TI到CHO-S Hipp11位點和HEK 293T細胞的ROSA26位點。TARGATT LP由一個盒組成，共表達嘌呤黴素抗性蛋白、HSV-TK和phiC31整合酶，所有這些都由PGK啟動子驅動（PGK + Puro+T2A + TK + IRES + PhiC3），兩側為phiC31 attP位點。他們還在重新靶向供體載體骨架中添加了HSV-TK基因，與LP中的HSV-TK基因一起，允許使用GCV選擇消除不需要的整合物。在ganciclovir（GCV）選擇之前，RMCE的效率為13.1%，在CGV處理后為97.7%。

2019年，Novo Nordisk Foundation中心的Pristovsek等人結合使用CRISPR-Cas9和RMCE系統，為CHO細胞中三個新提出的安全港位點的不同表達盒設計進行系統評估，開發了一個模塊化工具箱。使用CRISPR-Cas9介導的loxP包圍LP的TI產生PCL，攜帶EF1α-mCherry盒。值得注意的是，聚（A）被放置在LP之外（聚（A）陷阱）。生成的PCL允許快速整合不同的5'近端調控元件（啟動子和Kozak/翻譯啟動序列（TIS）），然后是GOI，評估整合位點和載體元件之間相互作用引起的效果。這項研究考慮了控制最終重組蛋白表達的四個不同層面：克隆背景（五個親本克隆）、染色體環境（三個整合位點）、載體設計（六個5'調控元件）和重組蛋白類型（三種不同的重組蛋白）。這產生了這四個特徵的270種可能組合，其中隨機選擇了66種。他們得出結論，穩定的基因表達既依賴於構建體，也依賴於位點。

5.2.多盒式整合

由於單個轉基因副本的生產力較低，近年來多拷貝特異性整合（TI）受到了廣泛關注，混合方法在這方面提供了幫助。在這方面，Gaidukov等人在他們新確定的選擇位點中構建了單、雙和三LP細胞系。不同的選擇標記（包括抗生素抗性和報告基因）以及LP中的Bxb1/attP位點允許在LP細胞系中有效插入多達9個mAb拷貝（將三拷貝mAb有效載荷整合到三重LP細胞系中），並明確了mAb表達與拷貝數之間的線性相關性。

Genentech的Carver等人使用了一個新開發的TI宿主，該宿主包含一個帶有三個不兼容的LoxP位點（L3、LoxFAS和2L）的LP熱點，以評估抗體HC和LC基因劑量和配置對蛋白質生產力的影響。由於LP設計允許在同一位點同時整合兩個供體質粒，他們也評估了當HC和LC都從同一質粒表達或分別在前后質粒上表達時的位置效應。此外，這種TI宿主為利用優化的鏈比例鋪平了道路，這是有效多鏈格式組裝的關鍵參數。他們表明，七鏈配置（HLL-HLHL）具有更高的滴度和特定生產力。

圖3 各種着陸墊設計策略。(a) TARGATT着陸墊。着陸墊供體具有由PGK啟動子驅動的盒式結構，共表達嘌呤黴素抗性蛋白、1型單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）和phiC31整合酶。該盒式結構由一對phiC31 attP位點所環繞。爲了在不融合它們的情況下共表達這些蛋白，使用了一種來自蠕蟲病毒2A（T2A）的核糖體跳躍序列，以及一個內部核糖體進入位點（IRES）。(b) 帶有熒光標記且無抗生素選擇的着陸墊。着陸墊載體包含pEF1a啟動子，后跟重組酶靶位點、TK表達單元，以及SV40啟動子驅動EGFP表達，后跟第二個重組酶靶位點。此着陸墊由CHO-K1基因組Fer1L4位點的1 kb同源臂所環繞。(c) 採用混合方法（啟動子陷阱和聚A陷阱）的着陸墊。供體質粒包含帶有loxP和lox2272序列的着陸墊，這些序列環繞mCherry基因。EF-1α啟動子和BGHpA位於lox序列之外，允許在RMCE期間進行啟動子和聚(A)捕獲。在供體質粒上同源臂之外放置了編碼短壽命綠色熒光蛋白ZsGreen1-DR的基因，以排除隨機整合事件。(d) 基於聚(A)陷阱的着陸墊。LP供體質粒由mCherry和選擇標記（NeoR）表達盒組成，由長5'和3'同源臂所環繞，與感興趣位點同源，以及在同源臂之外的ZsGreen1-DR表達盒，以排除隨機整合子。(e) 用於多重TI的着陸墊。帶有聚(A)陷阱的着陸墊具有由EF1α啟動子驅動的mCherry熒光標記，被loxP和lox2272重組位點所環繞，lox位點外有一個BGH聚(A)尾部，允許EF1α-mCherry到GOI的RMCE，后者具有不同的5'調控序列。

在Sergeeva等人的研究中，他們將一、二、四和六個拷貝的促紅細胞生成素整合到一個MCL中，該MCL具有一個表達mCherry的LP，由loxP重組位點包圍，BGH polyA和新黴素抗性基因位於LP之外。由於在克隆驗證、轉錄干擾和潛在重組方面存在挑戰，具有兩個以上GOI拷貝的質粒的單點多拷貝TI證明是有問題的。因此，一種將供體質粒同時整合到兩個不同的CHO基因組位點的雙RMCE系統被認為是多拷貝TI整合的替代方法。利用這個系統，多達四個轉基因拷貝成功整合到CHO基因組位點。

2021年，Xiong等人描述了CRISPR/RMCE組合的新應用。他們提供了一個新的無病毒（VF）篩選平臺，並在CHO細胞中進行了確認。在他們的研究中，他們使用了一種帶有bxb1 RMCE LP的CHO-S細胞系，該LP包含一個mCherry表達單元，由SV40啟動子驅動的潮黴素抗性基因（hygroR），兩側為bxb1目標位點（attP和突變attP），以及5'端的EF-1α（pEF1a-attP-mCherry-HygroR-attP）。這種細胞系，稱為CHO-attP-mcherry，被利用於gRNA質粒庫的TI，作為基於慢病毒的方法的替代。用於RMCE的gRNA表達盒兩側為重組酶靶位點（attB和突變attB），並且在重組酶位點內放置了一個無啟動子的嘌呤黴素抗性基因（PuroR），以富集正在進行準確RMCE的細胞。全基因組VF庫包含75,488個獨特的gRNA，針對15,028個基因。在數據噪聲更少、克隆間變異更低和穩定性方面，這種技術優於基於慢病毒的方法。

2021年，Shin等人應用了與CRISPR-Cas9配對的RMCE，研究了在需要多基因表達時，不同條件下RMCE的效率，以簡化CLD流程。他們使用了他們之前生成的單LP（sLP）MCL，該MCL在AAVS1位點處含有一個loxP-EF1α-mCherry-lox2272 LP，利用HEK293細胞的ROSA26位點作為第二個目標位點，開發了兩種類型的雙LP（dLP）MCL。同質dLP MCLs（用於整合兩個相同的GOIs）具有一個loxP-EF1α-tagBFP-lox2272 LP，而異質dLP MCLs（用於整合兩個不同的GOIs）在ROSA26位點處有一個attP-EF1α-tagBFP-attPmut LP。LP外也引入了潮黴素抗性基因。三種不同類型的核定位信號（NLS）序列，SV40、cMyc和核蛋白（NP），被附加到重組酶蛋白上，三種不同類型的DNA核靶向序列（DTSs），SV40、糖皮質激素響應元件（GRE）和核因子κB（NF-κB），被添加到基因表達盒的外部，以提高RMCE組分，即重組酶蛋白和供體質粒的核運輸。在sLP和同質dLP中，NP N-末端NLS和NF-κB 5'/3' DTS最有效，當兩者都使用時報告了最高效率。在異質dLP（含有Bxb1/attP LP）中，當應用NP C-末端NLS和NF-κB 5'/3' DTS時，RMCE效率最好，並且在存在NP C-末端NLS和NF-κB 5'/3' DTS時最高。

6.挑戰與未來方向

迄今為止，CHO細胞株開發（CLD）中特異性整合（TI）方法的主要目標是在資源和時間上顯著節省，用於CLD，從而縮短治療蛋白的「臨牀時間」。有效且精確的無疤痕靶向基因整合對於未來的基於CRISPR-Cas9的CLD將非常有意義。結合RMCE與針對CHO熱點的LP特異性整合已被證明可以構建一個無骨架的TI平臺，這在生物製藥生產方面更為可取。更重要的是，工業觀點傾向於使用真實的蛋白表達數據來評估熱點，避免將報告蛋白數據不精確地推斷到重組蛋白上。在TI觀點的初步階段，最明顯的挑戰是與傳統的RI技術相比，蛋白產量滴度相對較低。然而，隨着更具轉錄活性的安全港位點的引入，以及多基因盒或多LP整合，這一挑戰正逐漸被克服。在特定基因組位點增加基因拷貝數並沒有與生產力形成線性關係，主要是由於轉錄干擾。因此，這方面的未來方向需要集中在正確的、適用的空間上，以避免轉錄干擾，即可能需要分散的基因組位點來充分利用過量複製品的轉錄優勢。另一方面，目前CRISPR-Cas9系統在工業應用中最重要的障礙是知識產權（IP）問題，這個問題可能在未來幾年內仍然無法解決，並且越來越複雜。這個問題可以通過探索新的基因組編輯工具或應用替代酶，包括Cas13和Cas14，或者工程化新的CRISPR酶，如比Cas9更具特異性的基礎編輯器，來克服，以實現工業目的的基因編輯，如商業CHO CLD或工程（CRISPR專利分析，2021；IP研究；Ledford，2022）。在這個時代的未來發展可能還會強調靶向工程和異源基因的TI到基因組「熱點」，以確保強大且高滴度的治療蛋白生產。通過TI過度表達抗凋亡、促增殖的分子伴侶基因和參與代謝和分泌途徑的基因將非常有意義。在表3中，列出了在CHO細胞株中實施CRISPR技術用於SSI的研究。此外，一些已被證明在生產力或生長速率方面有效的基於microRNA的工程方法，如miR-17、miR-19b、miR-20a、miR-1287等，可以考慮作為TI的候選基因，從單一或多重角度來看（見表S3）。長非編碼RNA（lncRNAs）也被譽為新的和強大的CHO細胞工程工具，預計將產生相當大的科學影響。

表3 報道的用於CHO細胞系中與CRISPR-Cas9相關的敲入策略

1 中國倉鼠卵巢。2 環狀供體質粒。3 單LP細胞系1。4 三重LP。5 單克隆抗體。6 依那西普，一種抗TNF-α融合蛋白。7 促紅細胞生成素。8 生長/分化因子5。9 C1酯酶抑制劑10 Hipp11基因。11 綠色熒光蛋白。12 經G418選擇后。13 每細胞每天每克。14 複合啟動子。15 增強型綠色熒光蛋白。16 增強型綠色熒光蛋白。17 雙重基因敲除。18 8-氧化鳥嘌呤DNA糖基化酶。19 參與8-氧化鳥嘌呤鹼基切除修復的兩個關鍵酶。20 二氫葉酸還原酶。21 CRISPR干擾。22 粒細胞集落刺激因子。23 CRISPR干擾。24 Bcl-2同源拮抗劑/殺手。25 Bcl-2相關X蛋白。26 活細胞密度。27 基因敲入。28 次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶。29 同源重組。30 CRISPR介導的精確整合到目標染色體。31 微同源介導的末端連接。32 紅色熒光蛋白。33 單鏈可變片段抗體（scFv）與恆定片段（Fc）的融合。34 同源非依賴性靶向整合。35 非同源末端連接。36 紅色熒光蛋白。37 C1GALT1C1。38 甘露糖基（α-1,3-）-糖蛋白β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺基轉移酶，以及39 乳酸脱氫酶A。40 相對特定生長速率的變化。41 傳統環狀供體。42 雙切割供體。43 雙重基因敲入。44 一種基礎遠紅色熒光蛋白。45 DNA連接酶IV抑制劑。46 G2/M細胞周期抑制劑氯化鋰。47 同源定向修復。48 α1,6-巖藻糖基轉移酶。49 線性供體質粒。50 瓜氏熒光素酶（作為富含二硫鍵的模型蛋白）。51 表達盒（EC：EGFPHsQSOX1b-(KDEL)作為EC#1和EGFP-HsQSOX1b-(KDEL)-BIRC5作為EC#2）。52 由胰高血糖素樣肽1與人類血清白蛋白組成的融合蛋白。

攜帶多個LPs的工程細胞株可能被視為有用的平臺，用於在不同位點整合各種治療性轉基因和工程構建（蛋白質、micro-RNA或lncRNA），這些可以作為為生物製藥應用量身定製的重組細胞株。基於生物信息學和系統生物學工具的廣泛基因組熱點的精確評估能夠為提高LP攜帶細胞株的表達水平以及克隆穩定性結果鋪平道路。

（轉自：抗體圈）