萬字長文！深度挖掘DS-8201a！期待下一個破局者

轉自：藥渡

作者｜知乎_西山含黛

fam-Trastuzumabderuxtecan-nxki (Enhertu®)是Daiichi Sankyo開發的一款靶向HER2的ADC藥物，又稱為DS-8201a或T-DXd，用於HER2+/Low表達/突變的實體瘤，其在業內廣為人知。DS-8201a通過可酶切的四肽Linker (GGFG)將人源化抗HER2抗體(IgG1)與拓撲異構酶I抑制劑偶聯製備而成。

DS-8201a的成功離不開縝密的專利佈局(圖1)。所用抗體源頭專利到期(Tras，WO9222653)和Linker、Payload的專利自有(US5658920/US6436912)，為其消除了大部分的產品侵權問題；ADC各種舊元素的新組合(WO2014057687/WO2015115091)帶來了意想不到的活性效果，使得該款藥物能在ADC日益激烈的HER2競速賽道上得到破壁；對DS-8201a的專利進行迭代/衍生、提早佈局等，延長了DS-8201a的市場獨佔期。

誠然，不論如何佈局，也會存在一定的破壁者(WO2022033578)，不過，DS-8201a本身就是一個破壁者。

DS-8201a作為新一代ADC改良的標杆，DS-8201a已在不同腫瘤中體現了其卓越的治療實力。市場方面也體現了凌厲的銷售攻勢，2022年銷售額漲勢如虹，全年營收為1616億日元，約合12.38億美元，同比上漲191% (2021年4.26億美元)。隨着其在乳腺癌領域(HER2+, HER2+/Low/HER2 Mutant, Triple-negative BC)的全線推進，以及其他腫瘤治療領域(mNSCLC, GC)的開發，DS-8201a有可能成為ADC市場的超重磅炸彈(圖2)[1]。

01

DS-8201a的成功：離不開早期設計

DS-8201a能夠如此成功，主要是其具有多項創新性特徵[2]：高效的新型Payload (半衰期短、可發揮旁觀者效應)，高DAR值，良好的同質性，腫瘤選擇性可裂解Linker，血液循環中穩定的Linker-Payload。

DS-8201a的Linker-Payload以Exatecan mesylate (DX8951f，8)作為起始原料，經兩步成酰胺反應引入GGFG四肽Linker (Glycyn-Glycyn-Phenylalanyn-Glycyn)和可與巰基反應的馬來酰亞胺基團(mc-GGFG-DXd，圖3)[3]；然后採用傳統的半胱氨酸偶聯策略，利用TCEP打開鏈間二硫鍵，與mc-GGFG-DXd偶聯得到DS-8201a (9，圖3)。

早期研發階段，研究人員構建不同種類的Linker-payload並通過控制TCEP、Linker-Payload的反應當量數構建含有不同DAR值的ADC，對其進行理化性質及抑制活性的驗證(圖3右下)。儘管所有ADC(9-17)在體外均表現出較強的細胞毒性，但與其他ADC相比，ADC (12)和(13)的細胞毒性較低，且ADC (12)的聚集程度較高(26%)。

據推測，細胞毒性較低的原因是由於釋放的藥物部分的空間位阻導致腫瘤細胞中的降解酶可能無法有效發揮切割作用，釋放的藥物發揮毒性作用。因此，通過在GGFG與DXd之間添加不同長度的亞甲基鏈[(-CH2-)n]，使得可裂解的酰胺基團在空間上遠離Payload，ADC (14-17，n=2-5)釋放出具有亞甲基烷基鏈的烷基胺DXd衍生物，顯示出較高的體外活性。然而，ADC (17，n=5)有較高的聚集傾向(20%)，可能是由於亞甲基烷基鏈的疏水性所導致的，低程度的亞甲基修飾(n=1-4)對聚集程度的影響無明顯差異。因此可知DXd衍生物的烷基鏈的長度影響聚集程度。從ADC的物理化學性質的角度來看，優選烷基鏈的長度應2≤n≤4。此外，在mc段PEGylation修飾以及在GGFG與DXd之間引入氧亞甲基可顯著降低聚集體的產生，ADC(9-11)顯示出更低的聚集程度，即便是具有較高DAR值(7.7/6.2)也具有可接受的低聚集性和更高的體外抑制活性。

傳統觀念認為較高的DAR值會導致ADC異源性增加，體內清除加快，導致治療指數的降低[4]。但在DS-8201a的早期研發過程種並未採取將DAR值控制在4的策略，而是通過控制TCEP、Linker-Payload的反應當量數構建高DAR值(7.7) ADC藥物，在提高載藥量的同時也可降低ADC的異質性[5]。此外，研究人員也未採用活性最好的ADC進行后續的試驗，而是選取ADC (9)的Linker-Payload結構進行后續的優化和臨牀試驗評估。

之所以選擇ADC (9)進行研究是因為不同亞甲基修飾的ADC經酶切釋放的Payload代謝物在結構中含有源自Linker部分的伯氨基(-NH2)，導致其細胞膜通透性受損；而ADC (9)經酶切釋放的Payload雖然含有伯氨基(18)，但其作為自降解間隔子氨基亞甲基的一部分會自發消除，產生含有羥基的Payload (DXd，19)，具出膜通透性，使其在腫瘤異質性的環境中具有更高的療效；然后在體內水解酶的作用下，DXd可能進一步水解產生具有更高活性的依喜替康(Exatecan，推斷，圖4A)。相較於DXd/SN-38，其母本藥物Exatecan擁有諸多的優勢：較高的TOP1抑制活性[6, 7](圖4B)；對ABCG2G/P-gP等藥物外排泵蛋白低敏感性，具有更少的Payload外排[8](圖4C)；較高的滲透性和旁觀者穿透效應[9, 10]。因此，DS-8201a在腫瘤異質性以及在含有ABCG2G或P-gP等多藥耐藥轉運體的腫瘤中發揮良好的抗腫瘤效果，擴展了相關適應症。

在同類靶向HER2的ADC藥物中，DS-8201a活性優於T-DM1，其對T-DM1不敏感/耐藥(Insensitive/Resistance)的腫瘤細胞有較好的治療效果。一部分原因是由於Payload造成的，DS-8201a擁有較高的DAR值(~7.7)，T-DM1的DAR值相對較低(~3.5)，DS-8201a內化后所釋放的Payload較多，高載藥量可發揮更具殺傷力的細胞毒性作用；此外，DM1作為藥物外排泵蛋白(ABCC2/ABCG2)的良好底物使腫瘤細胞內DM1濃度相對較低[11, 12]，但DXd/Exatecan的底物敏感性較差，外排較少，胞內濃度較高可以發揮足夠的殺傷作用[13]。因此，針對T-DM1不敏感/耐受的腫瘤使用DS-8201a可以展示良好的抗腫瘤活性[14, 15]。

DS-8201a與T-DM1進行了頭對頭臨牀試驗(DESTINY-Breast03，NCT03529110，Phase III)，DS8201組和T-DM1組患者12個月的預估OS率分別為94.1%和85.9%，基於良好的臨牀試驗結果，FDA也正式批准DS8201的二線適應症[14]；此外，用於評估DS8201與T-DM1新輔助治療高危或有殘留浸潤性淋巴結的HER2陽性原發性乳腺癌患者的臨牀試驗(DESTINY-Breast05，NCT04622319，Phase III)也正在招募患者中，期望DS-8201a能有良好的治療效果。

02

DS-8201a：

新穎的作用機制+旁觀者效應

DS-8201a的偶聯方式是通過還原劑TCEP•HCl打開抗體鏈間的二硫鍵，將Linker-Payload連接到裸露的半胱氨酸殘基上，產生高DAR值的偶聯物。該種偶聯方式可能會影響抗體的結構(Architecture)，從而進一步影響抗體的功能[16]。通過ELISA實驗發現DS-8201a的Kd值為7.3 ng/mL，Trastuzumab的Kd值為7.8 ng/mL，表明高DAR值並不會過多的影響DS-8201a與HER2的結合活性(圖5A)。

Trastuzumab的主要作用機制涉及ADCC[17]以及下調磷酸化Akt (pAkt)水平並抑制細胞增殖[18]。實驗表明DS-8201a仍然保留了與Trastuzumab相同的作用機制。DS-8201a在人外周血單核細胞(PBMC)介導的SK-BR-3細胞中顯示出ADCC活性，最大ADCC活性可達48.6%，EC50為3.8 ng/mL (圖5B)，與Trastuzumab相似。關於Akt磷酸化水平的抑制，DS-8201a以劑量依賴性方式誘導SK-BR-3細胞中胞內pAkt(Ser473)的下調，在相同條件下對照IgG ADC不影響Akt的磷酸化水平(圖5C)；Trastuzumab降低了約70%的Akt磷酸化，表明DXd偶聯可能增強未綴合的Trastuzumab對pAkt的下調作用。以上數據表明DS-8201a在DXd偶聯后仍保留了Trastuzumab的功能。另一方面，DS-8201a(10 mg/mL)可誘導Chk1和組蛋白H2A.X的磷酸化(DNA損傷Marker[19, 20])以及PARP裂解(凋亡Marker[21])，10 mg/mL的抗HER2 Ab在相應時間點都不會引起任何目標蛋白的變化，這些結果表明DS-8201a以與DXd相同的方式誘導DNA損傷和細胞凋亡。因此，DS-8201a通過一種新穎的作用機制表現出HER2特異性細胞生長抑制和抗腫瘤活性。

另一部分高抗腫瘤活性的原因則是DS-8201a旁觀者效應的加持，通過轉移抗原表達腫瘤細胞釋放的Payload (DXd/Exatecan，高滲透性)至鄰近的抗原陰性細胞發揮「殺」屋及烏的毒性作用[22]；T-DM1由於裂解不完全，導致毒素上殘留一個帶正電的賴氨酸(Lys-SMCC-DM1，低滲透性)，這使其無法透過腫瘤細胞膜，因此其不會產生旁觀者效應(圖6A)[23-25]。通過體外共培養細胞實驗驗證DS-8201a的旁觀者效應，將HER2+KPL-4細胞和HER2-MDA-MB-468細胞以適當比例混合並培養過夜，用ADC處理細胞5天，然后測定活細胞的數量。T-DM1僅完全殺死HER2+KPL-4細胞，但DS-8201a卻可以同時殺死KPL-4和MDA-MB-468細胞；與未處理的孔相比，陰性對照ADC不會誘導細胞死亡(圖6B)。以上數據表明MDA-MB-468細胞殺傷是由釋放的DXd/Exatecan引起的，説明DS-8201a在細胞水平上具有旁觀者殺傷作用。

DS-8201a的旁觀者效應在體外實驗得到驗證后，通過MDA-MB-468-Luc細胞構建的腫瘤異種移植模型(PDX)利用體內成像系統檢測其體內旁觀者效應(圖6C)。將每種實驗/對照ADC給予共同接種的異種移植小鼠，並測量每隻小鼠的腫瘤體積和熒光素酶活性。在DS-8201a實驗組中，可觀察到熒光素酶信號明顯減少，表明MDA-MB-468-Luc細胞被DS-8201a完全根除；其他HER2靶向ADC或對照ADC未觀察到類似結果；就腫瘤體積變化而言，T-DM1抑制腫瘤生長，但不如DS-8201a有效，這可能是由於腫瘤消除有限，僅消除HER2+腫瘤(圖6C)。免疫組化研究表明，T-DM1治療組中HER2+細胞被根除，而HER2-癌細胞佔據了腫瘤組織的大部分；在DS-8201a治療組中，幾乎所有HER2+和HER2-細胞消失，腫瘤中幾乎沒有癌細胞殘留。這些結果證實，在共同接種條件下，DS-8201a不僅對HER2+腫瘤有效，而且對HER2-腫瘤也顯示出抗腫瘤活性，而T-DM1對HER2-腫瘤沒有作用。

DS-8201a除對鄰近HER2-細胞有旁觀者作用外，對其遠端癌細胞是否擁有旁觀者效應進行驗證。將NCI-N87和MDA-MB-468-Luc細胞的混合物接種到小鼠的右脅腹中，並且僅將MDA-MB-468-Luc細胞接種到同一小鼠的左脅腹中。DS-8201a治療14天后，聯合接種腫瘤的熒光信號減弱，但單獨接種腫瘤的熒光信號沒有變化，與未治療組小鼠熒光信號相當(圖6D)。這些結果表明，DS-8201a對HER2-細胞的影響僅在與HER2+細胞相鄰的細胞中觀察到，而在遠端細胞中未觀察到抗腫瘤作用。

基於旁觀者效應可以解決腫瘤異質性的問題[26]，DS-8201a被開發用於多種腫瘤異質性的癌症治療(表1)。

表1. 基於DS-8201a旁觀者效應開展的臨牀試驗

03

GGFG四肽Linker功不可沒

以上所提到高DAR值、旁觀者效應均是Payload所貢獻的，Payload能發揮如此作用，其多肽Linker發揮着重要的作用。

Linker的重要性經常被忽略，大家僅僅認為其是Antibody和Payload中間部分(「the piece in the middle」)，其實Linker是ADC中較為關鍵的中間部分(Crucial 「Part in the Middle」)[27]。Linker的化學和生物物理特性在ADC的設計中起着至關重要的作用，其化學特性會顯著影響ADC的生物物理性質和生化穩定性，進而對藥效學和藥代動力學產生深遠的影響[28]。爲了使ADC具有選擇性和抗腫瘤活性，所採用的Linker應努力實現三個關鍵特性：(1)循環穩定性高，避免Payload的過早釋放；(2)高水溶性，有助於生物偶聯並避免形成無活性的ADC聚集體；(3)能夠有效地釋放高細胞毒性的Linker-Payload代謝物[29, 30]。

DS-8201a通過GGFG四肽Linker將抗體和Payload偶聯在一起(圖3)，該Linker在小鼠、大鼠、猴和人血漿中DS-8201a的DXd釋放率為1.2%至3.9%，特別是在人血漿孵育21天后，DXd的釋放率低至2.1% (圖7A)，與其他ADC (如T-DM1、SGN-38）相當或相對較低[15]；同時在獼猴中研究DS-8201a的藥代動力學(Pharmacokinetics，PK)特徵，數據顯示其與總抗體之間無明顯差異(圖7B)，即便是在不同的給藥劑量下二者PK參數也無明顯差異(圖7C)[31]，這説明DS-8201a的GGFG四肽Linker即使在DAR=8的情況下在血漿中的穩定性也是極好的，僅在有限的時間點檢測到低水平的DXd釋放。

04

DS-8201a與腫瘤免疫檢查點的combo

上述數據主要講述了DS-8201a作為ADC所發揮的抗腫瘤作用，除此之外，DS-8201a還可以引起免疫系統激活，從而提升抗腫瘤免疫[32]。在具有免疫能力的小鼠體內接種人HER2的CT26細胞(CT26.WT-hHER2, s.c.)，荷瘤小鼠使用DS-8201a進行抗腫瘤治療，將獲得完全緩解(Complete Response, CR)的小鼠再次接受CT26.WT-hHER2挑戰后發現小鼠可以抵禦新接種的腫瘤(圖8A)；同時，細胞因子IFNγ (主要有活化的T細胞、自然殺傷細胞產生[33])的分泌也在增加(圖8B)。以上數據説明DS-8201a誘導的T細胞不僅可以識別人HER2，還可以識別腫瘤細胞的其他抗原。即使是在對DS-8201a細胞毒活性不太敏感的腫瘤中，適應性免疫也可被激活，CD8+T細胞(CD45+CD3+CD8+細胞)和顆粒酶B+的CD8+T細胞比率明顯增加(圖8C)；當採用anti-CD8耗竭Ab消耗掉CD8+T細胞時，DS-8201a的抗腫瘤活性基本上消失(圖8D)。與對照組相比，CD8+T細胞顯着增強DS-8201a在免疫活性小鼠模型中的抗腫瘤作用。

由於拓撲異構酶Ⅰ抑制劑可以激活樹突狀細胞(DC)[34]，所以DS-8201a內化后所釋放的DXd也可以使DC成熟/活化標誌物(CD86+MHC Ⅱ類)的標誌物增加，説明DS-8201a發揮抗腫瘤作用需要DC參與；經DS-8201a處理的小鼠體內DC細胞(CD45+ CD11c+ MHC classII+)佔比明顯增加，其中CD86+的DC細胞也明顯增加(圖9A)；這説明DS-8201a除發揮細胞毒性作用外，DC體內激活也是其發揮抗腫瘤作用的重要機制。此外，DS-8201a還可以增加免疫相關分子(PD-L1/ MHC Ⅰ類)的表達(圖9B)，MHC I類的表達增加抗原呈遞，促進T細胞識別腫瘤[35]；另一方面，PD-L1表達增加可能是一種負性調節的結果，由於T細胞激活或體內產生抑制信號而降低體內抗腫瘤免疫力。

因此，採用「萬金油」-免疫位點阻斷劑(ICI，尤其是抗PD-1/PD-L1阻斷劑)與DS-8201a聯用可以阻斷抑制信號，發揮更好的抗腫瘤效果。利用抗PD-1抗體、DS-8201a或聯用療法治療荷瘤小鼠(CT26.WT-hHER2, s.c.)，38天后各治療方案的存活率分別為20%、20%和80% (圖9C)；單一療法雖然能夠延長總生存時間，但聯合療法對總生存時間的延長明顯增加。基於以上動物實驗數據可以説明抗PD-1抗體可以阻斷PD-1/PD-L1抑制信號通路，並且能提高DS-8201a的功效。

受到上述動物實驗DS-8201a和抗PD-1抗體聯合治療所產生的良好效果的影響，Daiichi Sankyo和AstraZeneca聯合多家藥企開展了兩項臨牀試驗評估聯合療法的抗腫瘤活性(表2)[36-38]，目前暫未有臨牀結果披露。基於動物實驗的良好活性，期待該種聯合療法能夠成為治療HER2+腫瘤的新的有效療法。

表2. DS-8201a和抗PD-1抗體聯合療法所涉及的臨牀試驗

針對DS-8201a臨牀前體內外抗腫瘤活性的其他研究，以及臨牀研究梳理，作者不再贅述。

05

DS-8201a：期待下一個破局者

▌ 提高安全性

在過去幾年里，ADC的設計改進取得了重大進展，重塑了多種晚期實體瘤的治療方法。ADC的預期原理是將細胞毒性分子與針對腫瘤特異性抗原的抗體連接來實現細胞毒性分子的靶向遞送，預計其細胞毒性將低於傳統化療。然而，大多數ADC仍然面臨着類似於細胞毒性Payload的脱靶毒性、靶向毒性和其他知之甚少且可能危及生命的不良反應，DS-8201a也不例外。DS-8201a自2019年12月20日批准用於HER2+不可切除或轉移性乳腺癌以來，其臨牀適應症的迅速擴大，隨之而來的是其安全性問題(表3)[14, 37, 39-41]，提高其安全性也勢在必行。

表3. DS-8201a所涉及的毒性副作用

如何降低DS-8201a乃至其他FDA批准ADC藥物的毒性問題成為目前ADC類藥物研發所面臨的重要問題。

除了可以通過劑量優化策略(劑量封頂、限制性治療持續時間、分次給藥、治療反應指導劑量調整、隨機劑量探索研究)、實時診斷、藥物基因組學指導的個體化用藥等方法在實現療效最大化的同時降低其副作用外，優化ADC的設計(抗體部分的創新、Linker化學的創新、Payload方面的創新)，ADC的每個元素組成的設計創新都可以實現藥理學特性的微調，並對安全性和耐受性產生潛在影響。

▌ 新一代ADC的優化

對於ADC中的Linker而言，當然不存在「One size fits all」的情況。迄今為止獲批的ADC藥物的Linker具有多樣性，包括可切割、不可切割的接頭，酸敏感、蛋白酶敏感的Linker，在ADC的作用機制中發揮關鍵作用[42]。

GGFG四肽Linker並非是「高山」不可逾越，它更像是一座「燈塔」指引我們前進，站在「藥王」的肩膀上讓我們走的更遠。隨着我們對ADC中使用的各種Linker的優化，並深入分析不同Linker的特性，解析其影響ADC功效和副作用的「特徵圖譜」，終會獲得安全有效的ADC用於癌症治療。

對於ADC中的Payload而言，現階段所批准ADC的Payload均為細胞毒性藥物，涉及Calicheamicin、MMAE/F、DM1/4、DXd、SN-38、PBD SG3199、Duocarmycin。

臨牀經驗表明，與ADC相關的大多數不良事件(Off-target/Off-tumour)在譜系、發生率和嚴重程度方面與Payload的不良事件相似[43]，廣為流傳的治療窗擴展概念也是不準確的（圖10）[44]，並且擁有相同Payload的不同ADC通常具有相似的毒性特徵，無論目標抗原有何不同[45]。

ADC並非一定要以細胞毒性藥物作為Payload，隨着研究的深入，大家開始拓展新型Payload，構建了多種新型抗體偶聯物-ISAC[46]、IM-ADC[47]、GC-ADC[48]等。隨着我們對ADC技術研究的不斷革新，採用不同種類Payload的ADC作為腫瘤學以外疾病領域治療藥物的開發也將會增加。

對於ADC中的Antibody而言，我們似乎已經形成了思維定式：ADC中的Antibody只需要發揮靶向作用將細胞毒性Payload遞送至目的細胞即可，其治療作用可以不用考慮，試問最開始研發抗體藥物的出發點是什麼，難道只是爲了增加靶向性、延長半衰期(部分GLP-1R藥物[49])？

隨着大家對腫瘤生物學研究的深入，非內化(Non-internalising) ADC[50]開始進入我們的眼簾，這消除了對高抗原表達的依賴，避免了潛在的低效內化，並且可以極大地將癌症靶標範圍擴大到細胞外腫瘤基質以及其他膜蛋白/胞外蛋白。此外，我們能否構建一種ADC使其既保留抗體的特異性又能維持抗體的活性，同時還能與Payload相輔相成發揮協同作用，這是一個值得深思的問題。

結語

「Magic Bullet」概念的提出者Paul Ehrlich認為科學的成功需要4G: Geduld、Geschick、Glück und Geld」(德語，耐心、能力、運氣和金錢)，希望這4G格言賦能大家ADC藥物的研發，在未來開發出更有效的「靈丹妙藥」，讓「High-hanging Fruit」變得觸手可及。

最后，借用周恩來總理的一首詩與諸君共勉！

《無題·大江歌罷掉頭東》

大江歌罷掉頭東，邃密羣科濟世窮。

面壁十年圖破壁，難酬蹈海亦英雄。

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