突破蛋白高表达量难关！药明生物T Cell Mate平台打造可溶性T细胞受体蛋白高效表达方案

“通过T Cell Mate平台，研究人员可提升蛋白生产效率，加速TCR筛选流程，推动新一代T细胞治疗药物的开发。”

导 语

药明生物CRO服务团队接受权威专业媒体GEN News邀请，就如何实现可溶性T细胞受体蛋白高效表达发表专题文章。药明生物CRO 服务团队凭借对多种药物形式的深厚技术积累和研发经验，提供从抗体发现、蛋白表达与工程改造，到体外测试和体内药理学等全方位服务，赋能客户的候选分子从概念验证无缝迈入CMC开发，全面加速药物研发进程。迄今为止，团队已成功赋能600多个T Cell Mate分子。此外，Protein Sciences团队累计生产超过10万个分子，涵盖单抗、双抗、融合蛋白等多种复杂类型。

为了提升CAR-T疗法的持久疗效，科学家们正在积极研究TCR信号传导和T细胞耗竭（T cell exhaustion）机制。此外，开发TCR-CAR复合体以增强T细胞疗效也成为新趋势1。这些进展需要表达T细胞相关蛋白，如T细胞受体（TCR）和肽-MHC（pMHC）复合物。然而，量产高质量、有效性的TCR和pMHC复合物仍挑战重重。

传统的大肠杆菌（E. coli）表达系统常常存在蛋白产量低、通量有限和内毒素污染等问题，限制了其在治疗性研究中的应用。为克服这些限制，药明生物蛋白质科学团队开发了T Cell Mate平台，实现了包括可溶性TCR（sTCR）、TCR融合蛋白和单链三聚体（SCT）在内的T细胞相关蛋白的高产量CHO表达，同时利用大肠杆菌重折叠技术生产pMHC复合物。此外，团队还采用高通量表面等离子共振（SPR）分析评估TCR-pMHC结合力，确保其特异性和功能性，满足后续应用需求。

CHO系统中可溶性TCR的生成

可溶性TCR（sTCR）在研究抗原识别和免疫应答机制中起到至关重要的作用2。然而，传统的大肠杆菌表达系统通常存在产量和通量低、内毒素水平高等问题，不适用于科研和治疗性应用。T Cell Mate平台解决了这些难题，实现了在CHO平台的高表达量、高通量sTCR生产，同时保持高纯度和低内毒素水平。

生产流程从密码子优化开始，随后克隆至药明生物专有载体中。转染CHO细胞并培养七天后进行蛋白表达。培养基澄清后，采用亲和层析和SEC纯化sTCR。最终通过SDS-PAGE、SEC-HPLC、LC-MS和内毒素检测对产品进行表征。

我们采用该方法已成功生产多种TCR构型。下图展示了在CHO细胞中生产的三种sTCR分子（图1）。单臂TCR-Fc融合蛋白、带His标签的TCR和scFv融合TCR的产量分别为1100 mg/L、130 mg/L和100 mg/L。如结果所示，药明生物的高表达量CHO瞬时表达技术显著提升了sTCR的产量。

图1 基于拉曼的PAT需依托强大技术平台，实现模型预测与反馈控制图1. 三种sTCR（单臂TCR-Fc融合、带His标签的TCR和scFv融合TCR）一步亲和纯化的SDS-PAGE（非还原/还原）分析

大肠杆菌中肽-MHC复合物的重折叠

正确折叠的肽-MHC（pMHC）复合物对于TCR特异性筛选至关重要。然而，不同实验室重折叠（RF）pMHC复合物的质量可能不一致，常导致后续实验表现不佳。优化大肠杆菌中的重折叠方法可生成高质量的RF-pMHC复合物。更重要的是，通过LC-MS分析等严格质控，可在下游实验前验证其结构完整性。

流程从密码子优化和克隆至表达载体开始，随后表达HLA和B2M蛋白的包涵体。包涵体随后被溶解，并通过优化的工艺促进HLA重链、B2M轻链和目标肽的重折叠。纯化包括AEX、体外生物素化和SEC，最终通过SDS-PAGE和LC-MS进行表征。

通过该优化重折叠流程，我们在大肠杆菌中成功生产了300多种RF-pMHC复合物，批量规模从0.1 L到50 L不等，显示了该方法的可扩展性和可重复性。LC-MS也证实了其结构完整性（图2）。

图2. RF-pMHCI生产流程，展示了用于纯度评估的纯化和质控流程（LC-MS和SDS-PAGE）

CHO系统中肽-MHCII复合物的生成

肽-MHCII（pMHCII）复合物对于CD4+ T细胞的激活至关重要3，但在传统表达系统中常难以高产高质表达。T Cell Mate平台利用高表达量CHO瞬时表达系统和优化的拉链融合构建体，显著提升了pMHCII复合物的表达水平和蛋白质量。

生产流程从将优化的序列克隆至药明生物专有载体开始，随后瞬时转染CHO细胞并培养七天。培养基澄清后，我们采用多步纯化流程，包括Ni亲和层析、拉链肽切割（可选）、AEX色谱法和SEC。最终产品通过SDS-PAGE、SEC-HPLC、LC-MS和内毒素检测进行表征。

采用该方法，CHO系统成功表达的pMHCII复合物产量超过500 mg/L（图3）。拉链融合构建体提升了表达水平和结构完整性。亲和纯化后，pMHCII复合物具有高纯度，满足多种下游应用需求。

图3. 四种pMHCII结构一步纯化的SDS-PAGE（非还原/还原）分析及产量对比

TCR-pMHC结合的高通量SPR分析

评估TCR-pMHC结合对于筛选高亲和力TCR候选分子和开发TCR相关治疗药物至关重要。高通量SPR分析可实时测量结合亲和力、结合/解离速率和相互作用特异性，从而筛选和选择最佳TCR候选分子。

在高通量SPR结合研究中，我们将多个TCR与来自CHO和大肠杆菌表达系统的pMHC复合物进行了测试（图4）。根据ka、kd、KD等动力学数据（表1），可有效筛选和甄选出具备高亲和力的TCR候选分子。

图4. TCR-pMHC相互作用的SPR传感图，pMHC分别由CHO和大肠杆菌表达系统生成

表1. SPR动力学数据汇总

结论

T Cell Mate平台为生产T细胞相关蛋白（如sTCR和pMHCII复合物）提供了解决方案，这些蛋白对于推进T细胞疗法至关重要。该平台利用高表达量CHO表达系统生产高产量、高纯度、低内毒素的蛋白。同时，大肠杆菌重折叠流程高效生成RF-pMHC复合物，并借助高通量SPR分析提供TCR-pMHC相互作用的动力学数据，从而支持TCR筛选和候选分子的甄选。通过T Cell Mate平台，研究人员可提升蛋白生产效率，加速TCR筛选流程，推动新一代T细胞治疗药物的开发。