金斯瑞基因合成服务助力！高彩霞团队开发可编程染色体编辑技术，实现从千碱基到兆碱基...

自CRISPR技术问世以来，基于CRISPR与其衍生系统的基因编辑技术层出不穷。人类的基因编辑技术在不到十五年内取得了举世瞩目的成就。CRISPR技术更是在里程碑论文发表九年后斩获了诺贝尔化学奖。但美中不足的是，目前的绝大部分基因编辑都聚焦于小片段DNA甚至是碱基编辑，我们的工具库中缺乏能够高效编辑几千碱基到兆碱基级别DNA的大尺度基因编辑系统。

图片来源：Cell

近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所的高彩霞团队公布了他们最新研发的大片段DNA编辑工具，该工具能够在染色体层面实现大尺度的插入、删除、替换等精细操作，极大地丰富了人类处理大片段DNA的能力。该研究以Iterative recombinase technologies for efficient and precise genome engineering across kilobase to megabase scales为题，于八月发表在生物学顶级期刊Cell上。

提高Cre-Lox系统编辑效率

在本研究之前，科学家已经尝试将Cre-Lox系统与CRISPR技术结合来实现大段DNA的编辑，但这些技术大多编辑效率低下，编辑尺度也较低。同时，Lox位点的存在会在基因中引入残留的碱基，这可能干扰附近基因的表达，这些残留碱基也被称为「疤痕」。

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由于Lox位点主要为互补设计，互补的序列会导致可逆重组的发生。这种可逆性极大的限制了基因编辑的效率与适用范围。为了解决这个问题，研究人员建立了分别带有一个Lox位点的两个质粒库，并通过引入随机突变设计了一个高通量的Lox位点偏好性研究系统。通过这个系统，研究人员发现Lox位点的左臂比右臂更保守，并根据碱基偏好找到了Lox71和LoxPF两个位点。

基于这些位点，研究人员设计了4个对称的Lox位点，并开创性地设计了多个非对称的Lox位点，然后评估了这些位点的重组频率与可逆性。不出所料，非对称的Lox位点设计有效降低了Cre-Lox系统的可行性，几乎达到了阴性对照水平，而重组效率最高的Acm8和此前报道的位点活性相似。

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在解决了Lox位点的可逆性问题后，研究人员将目光转向了Cre重组酶，并试图进一步提高其重组活性。在同期Cell上，高彩霞团队背靠背发表了一项利用AI技术识别优质突变的研究，但这个名为AiCE的方法并不适用于Cre重组酶这种高度复杂的四聚体系统，更不用说这个四聚体还涉及与DNA的复杂交互。

因此，研究团队对AiCE进行了改造，将突变优势与分子相互作用进行了关联，并得到了重组酶专属的AiCE_rec。利用AiCE_rec，研究人员设计出了24个Cre的单点变异体，并找到了8个活性显著提高的单点突变。通过将这些单点突变进行组合，研究人员得到了27个新的突变体，而第24个（cm24）表现出了最高的活性，其活性为野生型的3.5倍。同时，研究人员也探究了cm24所具备的H40E, D141Q, A275P, K276P以及Q281G五个突变提高重组效率的分子生物学依据。

随后，研究人员将Acm8与cm24进行了组合，同时引入先导编辑系统对特定位点引入Lox位点实现「编程」，并将其命名为「可编程染色体编辑」（PCE）。

高效大尺度DNA编辑

得到PCE后，研究人员首先测试了该系统在水稻中插入18.8kb大片段DNA的效率。结果显示，比起此前报道的PrimeRoot系统，PCE的插入效率提升了2.3到4.7倍。同样的插入效率提升在其他植物与不同大小的DNA片段中得到了重现。这证明了PCE在植物中进行大片段DNA插入的优越性。

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除此之外，研究人员还探究了PCE对大片度DNA进行删除、替换、倒位和易位编辑的效率。较之基于非同源末端连接修复（NHEJ）的倒位编辑系统，PCE的倒位效率提高了17.6倍，在水稻中，优化先导编辑后的PCE能够对315kb的大片段DNA进行精准倒位，倒位率高达20.1%；而PrimeRoot的倒位率仅有2.8%。同时，PCE可以轻易替换5kb的DNA片段以及高达4Mb的基因删除，同时拥有约1%的染色体易位编辑效率。这些数据都证明PCE具有强大的大尺度基因编辑能力。

无痕编辑

当前PCE需要通过先导编辑引入Lox位点，但基于Cas9的先导编辑依赖前间隔相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM）发生作用。对PAM的刚需极大限制了Lox位点的选择，而此前报道的SpRY, BCA与FCA变体能够实现不依赖特定PAM的基因编辑。基于这些先例，研究人员利用此前报道的ePPEplus系统进行了快速进化，并得到了SpRY-ePPEplus。SpRY-ePPEplus能够对所有研究的PAM序列进行高效插入，这极大了扩宽了PCE的应用范围。

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在对Lox位点、Cre 重组酶以及先导编辑三个组件进行优化后，研究人员将目光转向了Cre-Lox系统留下的「疤痕」，这些疤痕的存在可能影响附近基因的表达。但研究团队已经获得了不依赖PAM的SpRY-ePPEplus，这意味着只要他们在PCE后再次进行先导编辑，就可以轻易把Lox位点留下的疤痕除掉。

通过二次先导编辑，研究人员最终获得了能够实现「无痕」编辑大片段DNA的RePCE系统，并在水稻中通过将GFP分三段引入后去除疤痕证明了其有效性。随后，研究人员对两次先导编辑的序列进行了进一步优化，解决了LoxP疤痕去除效果不佳的问题，同时进一步提高了无痕编辑的效率。

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最后，研究人员进一步探究了RePCE在人类疾病中的应用可能性，并对尤文肉瘤与非小细胞肺癌的致病基因进行了无痕编辑。尽管编辑效率不到2%，且存在一定程度的脱靶现象，但研究结果还是初步验证了RePCE在临床中应用的潜力，也为RePCE的进一步改进指明了方向。

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本研究通过一系列的巧思，解决了困扰基因编辑领域的数个难题，并搭建出来一个能够实现大片段DNA精准无痕编辑的系统，让人类获得了在染色体层面修改遗传信息的能力。

本研究中所用的Cas9变体（BCA和FCA）基因序列经密码子优化后由金斯瑞完成合成。

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参考资料：

1. Iterative recombinase technologies for efficient and precise genome engineering across kilobase to megabase scales: Cell

(金斯瑞生物科技)