默新探——探索Sf-RVN昆虫细胞表达系统的潜力与应用：推动疫苗与基因治疗的革命

近日，首个基于Sf-RVN®细胞表达的VLP疫苗获得药物临床试验批准，吸引了生物制药行业的广泛关注。在病毒样颗粒（VLP）的生产技术方面，昆虫细胞表达系统展现出革命性的潜力，成为疫苗研发的前沿方向。此外，在重组腺相关病毒（AAV）的生产中，昆虫细胞表达平台也展现出独特优势，包括更高的安全性、良好的可放大性、简化的工艺流程以及更低的生产成本。本文将深入探讨昆虫细胞表达系统的发展历程，揭示这一强大真核生物表达体系的实力。

昆虫细胞的历史与发展

自20世纪80年代开发昆虫细胞表达系统以来，它已成为重组蛋白、疫苗和病毒载体生产的重要平台。最早的应用可追溯到1983年，科学家首次利用杆状病毒（Baculovirus）感染昆虫细胞（Sf），成功表达外源蛋白。自1990年代起，该昆虫细胞杆状病毒表达系统（BEVS）因其高表达量、翻译后修饰能力及对大分子蛋白的良好折叠，广泛应用于科研和生物制药领域。

昆虫细胞的优势

与传统哺乳动物细胞相比，昆虫细胞具有更高的安全性，培养条件简单，易于大规模放大，且生产成本较低等特点。这些优势也使其成为重组蛋白、疫苗、新型基因治疗载体（如AAV，Glybera®）生产的理想选择。

类哺乳动物翻译后修饰能力

昆虫细胞（如Sf9/Sf21）可执行复杂的糖基化修饰，其N-糖基化模式比酵母/细菌更接近哺乳动物系统，特别适合生产需要正确折叠和功能修饰的治疗性蛋白。

杆状病毒表达系统的高效性

昆虫细胞在使用杆状病毒表达系统（BEVS）时，能够实现高效的重组蛋白生产。通过基因工程改造，昆虫细胞的存活率和产量得以提高。例如，研究表明，通过延长细胞的存活时间和优化培养条件，可以显著提升重组蛋白的产量。

生物安全性优势

由于昆虫细胞和杆状病毒对人类是非感染性的，这使得它们在生产治疗性蛋白时具有较高的安全性。这一点在疫苗生产中尤为重要，因为它们不会引起人类的免疫反应或感染风险。

工艺开发灵活性

昆虫细胞平台允许使用多种表达系统，包括传统的杆状病毒感染和直接的质粒转染。这种灵活性使得生产过程可以根据具体需求进行调整，适应不同类型的重组蛋白或病毒样颗粒（VLPs）的生产。

快速响应能力

昆虫细胞系统的适应性和快速生长特性，使得它们能够在短时间内进行实验和优化。这对于快速响应疫苗需求或新药开发至关重要，特别是在应对快速变异的病毒（如流感或SARS-CoV-2）时

昆虫细胞在疫苗开发中的应用

昆虫细胞表达系统在复杂蛋白结构的制备领域展现出革命性的潜力，尤其是在病毒样颗粒（VLP）的生产技术方面，已成为疫苗研发的前沿方向。VLP是由病毒蛋白自组装而成的纳米级结构，其大小和形态特征与天然病毒高度相似，但不含病毒复制基因组，从根本上消除了感染风险。由于保留了病毒来源的结构，VLP能够被宿主的免疫系统有效识别，从而诱导细胞和体液免疫反应。这些特性使得VLP在疫苗开发中尤为引人注目，因为它们不仅能有效激发免疫反应，还不会增加宿主细胞中病毒复制的风险，为新型疫苗的开发提供了安全性与高效性的创新路径。

基于昆虫细胞系的独特优势，杆状病毒表达载体系统（BEVS）已成为VLP生产的核心平台。该系统不仅能够实现复杂多聚体蛋白的精准组装（如流感病毒血凝素三聚体），还可快速完成从基因克隆到VLP纯化的全流程，显著优于哺乳动物细胞系统的生产周期。这种快速响应能力在应对流感、SARS-CoV-2等快速变异病毒时展现出独特的战略价值。

当前主流的VLP制备技术包括：

1. 经典的Bac-to-Bac系统

2. 基于MultiBac技术的多基因表达系统，或与多个杆状病毒载体共同感染昆虫细胞

3. 稳定重组昆虫细胞系的应用

4. 基于质粒的生产技术（Lampinen等成功制备诺如病毒、轮状病毒和肠病毒-LP，简化下游杆状病毒去除步骤）

昆虫细胞在基因疗法中的应用

基因疗法的复兴为无法治愈的疾病患者提供了救命选择，导致对大量高质量病毒载体的需求激增。无辅助的腺相关病毒（AAV）载体通常通过瞬时转染人胚肾（HEK）293细胞制备，使用三种质粒，分别携带：(1) AAV基因组转移载体，(2) 编码衣壳和复制蛋白的AAV Cap和Rep基因，以及(3) 腺病毒辅助功能。尽管这一系统在实验室规模上优化AAV载体非常方便，但由于转染过程的复杂性，它在大规模生产中面临重大挑战。

相比于稳定的染色体整合或瞬时转染，BEVS生产依赖病毒载体传递外源遗传信息，具有更易于放大、更高的灵活性、更快的制造速度、更低的成本和更具竞争力的滴度。生物制药公司正在利用昆虫细胞表达系统生产重组AAV（rAAV）以治疗遗传疾病。实际上，这种基于昆虫细胞的表达系统曾用于AAV基因治疗药物Glybera，该药物于2012年获得欧洲药品管理局（EMA）的批准。

表1. 基于BEVS的人类和动物商业化疫苗及治疗药物

安全性与监管挑战

对于生物制药行业而言，确保产品的安全性至关重要。监管机构要求在生物制药生产过程中进行广泛的病毒检测和清除程序。随着昆虫细胞在生物制药领域的应用越来越广泛，FDA、中国药典等对昆虫细胞的鉴定也提出了更具体的监管要求。

2025版药典《生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制》新增昆虫细胞鉴定的特殊要求：

“支原体/螺原体：

昆虫细胞，或细胞培养过程中使用了植物源性材料，应进行螺原体检查，所用方 法如培养法或核酸法应能检测中间原体属和虫原体属”

“种属性特异性外源病毒因子的检测：

昆虫细胞系，应考虑检测已报告污染的特定病毒(如诺达病毒)，或可能持续存在于昆虫细胞系中并已知对人类具有传染性的病毒。”

FDA行业指南：用于人类基因治疗研究性新药申请 (IND) 的化学、制造和控制 (CMC) 信息中对昆虫细胞库鉴定要求如下：

- For other animal or insect cells, we recommend tests for species-specific viruses, as appropriate. For instance, for Vero cells, we recommend testing for simian polyomavirus SV40 and simian retrovirus.

- For insect cells, you should evaluate the presence of arboviruses in a susceptible cell line, such as baby hamster kidney (BHK21) cells. Insect cell lines with known viral contamination should be avoided.

2014年，FDA逆转录病毒实验室结合传统方法（如RT-PCR和电子显微镜观察）与现代高通量测序（MPS）和深入的生物信息学分析，发现大多数Sf细胞（如Sf9）中都含有一种未知的Sf-rhabdovirus (Sf-弹状病毒)。通过对Sf9细胞过滤上清样本进行透射电子显微镜观察，确认了弹状病毒的形态。感染性研究表明，Sf-rhabdovirus可能在其他昆虫细胞系中引起短暂感染，但在人类细胞系中没有发现病毒进入或复制的证据。Sf-rhabdovirus序列也在Sf9细胞的母系Sf21细胞系中发现，但在其他昆虫细胞系中未发现，表明存在物种特异性感染。

Sf-rhabdovirus作为一种种属性特异性外源病毒因子，在使用昆虫细胞进行生产时需要通过多重策略进行严格控制，包括选择和测试细胞系、评估生产过程的病毒清除能力以及在生产的适当步骤中进行病毒检测，以确保产品的安全性和有效性。

Sf-RVN®细胞系—从源头提升安全性

Dr. Jarvis和GlycoBac实验室于2016年找到弹状病毒阴性的sf9细胞，并通过TBLASTN程序对大规模平行测序组装进行搜索，确认Sf-RVN®昆虫细胞系中不存在任何病毒序列。在对弹状病毒呈阴性的同时，该Sf-RVN®昆虫细胞系在密度、大小、倍增时间和形态上与感染弹状病毒的Sf9细胞系相似，证明其同时保持了标准Sf9细胞系的其他特征。默克为Sf-RVN®昆虫细胞专门发开的EX-CELL®化学限定昆虫细胞培养基，可实现该细胞系的优良生长和生产力。

图4. Sf-RVN®昆虫细胞与感染弹状病毒的Sf9细胞在密度（A）、直径（B）、倍增时间（C）和形态（D）方面的比较显示出相似性

Sf-RVN®昆虫细胞COA中螺原体和弹状病毒检测：

未来展望

在未来的研究中，科学家们可能会探索更多的昆虫细胞系的表达体系，以提高生产效率和产品质量。此外，结合人工智能和机器学习等新兴技术，优化昆虫细胞的培养和生产过程，将是一个重要的研究方向。总之，昆虫细胞平台以其独特的优势和广泛的应用前景，正在推动生物制药和疫苗开发的变革。通过合作与创新，昆虫细胞平台必将在未来的生物制药领域中发挥越来越重要的作用。

参考文献

1. Greco, M.; Xavier, E. Process Optimization of a Baculovirus-Insect Cell Expression System for Scalable AAV Production. A Merck poster. 

2. McNorton, S. Development of a Novel Sf9 Rhabdovirus-Negative Cell Line (Sf-RVN®) and Companion Chemically Defined Medium. A Merck White paper.

3. Sułek, M.; Szuster-Ciesielska, A. The Bioengineering of Insect Cell Lines for Biotherapeutics and Vaccine Production: An Updated Review. Vaccines 2025, 13, 556. 

4. Ma, H.; Galvin, T. Identification of a Novel Rhabdovirus in Spodoptera frugiperda Cell Lines. Journal of Virology 2014, 88(12), 6576 – 6585.

5. 2025版中国药典《生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制》

6. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs). Guidance for Industry

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